Beacon简化内化抗体发现流程，加速ADC药物开发

抗体因其多种作用机制而成为天然的有效治疗药物。其中一种关键机制是受体介导的内化。鉴于抗体与抗原结合的高度特异性，与药物、毒素或酶偶联的抗体可以作为具有特异性的细胞毒性递送剂，在最大化治疗效果，减少非靶向效应[1]。有效的治疗性抗体偶联药物（ADC）不仅需要对肿瘤抗原具有特异性结合能力，还需要内化有效载荷（payload）以发挥细胞毒性效应。ADC疗法开发更为复杂，涉及多个步骤，包括识别靶抗原、发现理想抗体、选择细胞毒性有效载荷和连接子（linker），以及优化偶联化学——所有这些步骤从最初研究到治疗应用可能需要数年时间[2,3]。在这个过程中，一个显著的瓶颈是缺乏早期阶段的检测方法来指导从数百个抗原结合克隆中筛选出功能性抗体[4]。

抗体内化可能很复杂且高度可变，这取决于许多相互作用的因素，包括抗体-靶标亲和力、表位可及性、细胞类型、靶蛋白表达程度、蛋白质周转等[5,6]。尽管流式细胞术、共聚焦显微镜和高内涵成像等广泛使用的方法对为研究抗体内化提供可靠方法，但它们在筛选大型抗体库时受到复杂检测操作、通量有限和相对较高成本等限制。鉴于这些挑战，一个用于在早期发现阶段识别抗体内化的高通量检测将极大地加速ADC的开发[6]。

布鲁克细胞分析（Bruker Cellular Analysis）提供了先进的抗体发现解决方案，使客户能够在一周内筛选到有价值的单克隆抗体（图1）。我们的方法注重初始阶段的功能性筛选，而不是产生一系列抗原结合hits后进行繁琐、昂贵且相对小规模的功能性分析。使用Beacon®单细胞功能表征平台，可以在一天内利用光电定位（OEP）技术分离数万个单细胞，再使用微珠和报告细胞检测抗体分泌、抗原结合和受体特异性内化（图1）。

以杂交瘤细胞系为模型，本应用说明展示了简化早期发现阶段内化抗体发现的新能力，超越了抗原特异性，实现了高通量、实时评估功能性抗体。我们的解决方案简化了筛选过程，使研究人员能够在发现阶段早期快速筛选、识别并战略性地导出具有最佳内吞特性的抗体。这种能力使得下游表征和优化能够集中在最有希望的候选抗体上，最终加速理想抗体进入临床应用的进程。

图1 | Opto® B Discovery工作流程能够在一周内实现B细胞分离、激活、自动化单细胞分离、高通量功能筛选以及单克隆抗体序列回收。

受体特异性内化的模型系统开发

作为模型系统，本初步研究使用了两种小鼠杂交瘤细胞，OKT8（CRL-8014）和OKT3（CRL-8001），它们分别表达针对人CD8和CD3的单克隆抗体（图2A）。此外，将JurkatCD3+/CD8-细胞作为阳性对照，RajiCD3-/CD8-细胞作为阴性对照，以证明受体特异性内化（图2B）。在芯片上的检测之前，我们通过芯片外的内化检测首先验证这些表达谱，其中报告细胞与等浓度的荧光标记的抗CD3或抗CD8抗体一起孵育。在与抗CD3抗体一起孵育的Jurkat细胞中观察到了抗体内化，但与抗CD8抗体一起孵育时则没有观察到（图2C）。相比之下，两种抗体在Raji细胞系中均未显示出内化（图2D）。

图2 | A) 利用杂交瘤OKT3和OKT8细胞系作为模型系统进行抗体内化实验开发，这两种细胞系分别表达单克隆抗CD3（蓝色）和抗CD8（灰色）抗体。B) JurkatCD3+/CD8-和RajiCD3-/CD8-细胞系被用作阳性与阴性对照，以展示受体特异性内化。C) JurkatCD3+/CD8-细胞系与D) RajiCD3-/CD8-细胞系在96孔板中与荧光标记的抗CD3或抗CD8共孵育后，所拍摄的20X倍率的落射荧光图像。

芯片上用于筛选内化抗体

的Assay设计

将抗体分泌的OKT3和OKT8细胞系的细胞悬浮液依次导入Beacon®系统上的OptoSelect®芯片的通道中。利用光电定位（OEP）技术在NanoPen®小室内进行单细胞分离后，细胞被培养并利用基于微珠和细胞的检测方法筛选抗体分泌和受体特异性内化。我们首先利用包被有小鼠特异性抗IgG抗体的检测微珠筛选抗体分泌，这些微珠悬浮在含有荧光标记二抗的培养基中（图3A）。将含有检测珠子的培养基导入OptoSelect®芯片的通道中，微珠直接在分泌细胞上方捕获抗体，导致二抗的荧光聚集（图3B和C）。

图 3 | A）用于检测抗体分泌的基于珠子的捕获检测试剂结合了anti-IgG偶联珠子和荧光团标记的二抗。B）将检测试剂导入到OptoSelect®通道中，C）通过延时成像来观察IgG分泌（绿色）。

为了快速筛选内化抗体，我们选择了一种快速且易于使用的pH敏感标记试剂。Invitrogen™ Zenon™ pHrodo™ Deep Red IgG Labeling Reagent（Z25622）是一种与pH敏感荧光团结合的Fc特异性多克隆Fab片段。在中性pH下几乎不观察到荧光，只有当它位于酸性的晚期内体或者溶酶体腔室时，荧光团才会变得明亮（图4A）。这种在细胞外的微弱荧光信号对于在Beacon®上进行快速、无需洗涤的检测非常有利。对于芯片上的检测，将表达感兴趣靶抗原的报告细胞悬浮在含有pH敏感内化试剂的培养基中，并导入OptoSelect®芯片（图4B）。从分离的细胞中分泌的抗体被内化试剂识别；然而，只有当抗体与报告细胞上的靶受体结合并内化时，荧光才会增强（图4C，Pen A）。不与靶受体结合的非特异性抗体不会被内化，将导致检测结果为阴性（图4C，Pen B）。

图4 | A）对于基于细胞的抗体内化检测，表达目标受体的报告细胞系被悬浮在含有内化试剂的培养基中。该内化试剂是一种与pH敏感荧光团偶联的抗IgG Fc特异性Fab片段，在碱性pH下荧光较弱，但在酸性条件下会变得明亮荧光。当分泌的抗体-Fab复合物通过受体介导的内吞作用进入细胞时，随着其被运输到酸性内体/溶酶体腔室，荧光会急剧增加。B）细胞和pH敏感的Fab试剂被导入到OptoSelect®通道中，C）通过延时成像来观察荧光的变化，从而指示抗体内化。图中（C）部分的彩虹“雷达”线有助于说明荧光扩散随时间的扩展。Pen A和Pen B来自图3中展示的同一实验。

芯片上的受体特异性抗体内化

鉴于本研究中模型细胞系的高抗体分泌率，我们在OptoSelect® 3500芯片的每四个NanoPen®小室中仅加载一个OKT3或OKT8细胞，以确保清晰的检测读数；得到的模式是在每种细胞类型之间留出一个空的小室（图5A）。为了方便起见，我们在芯片上对细胞进行过夜培养，并在第二天进行检测；也可以在同一天加载和检测细胞。利用之前描述的基于微珠的检测评估抗体分泌，识别两种杂交瘤细胞系阳性IgG “blooming”（图 5A）。

在IgG分泌检测之后，我们立即使用芯片内的基于细胞的检测来分析抗体内化。为了保持报告细胞的活性并避免培养基酸化，JurkatCD3+/CD8-或RajiCD3-/CD8-细胞在导入前新鲜制备。将细胞以最佳密度悬浮在含有内化试剂的培养基中，以填满通道区域（图5B和C）。利用Cell Analysis Suite（CAS®）软件中的Capture Assay操作，每隔10分钟获取一次荧光图像，持续1至2小时。预期能够与靶抗原结合并在内化进入报告细胞的分泌抗体（分泌anti-CD3的OKT3杂交瘤细胞）会在NanoPen®小室上方产生增强的荧光（图5B）。不被报告细胞识别或者能够结合但不内化的抗体，将不被判断为阳性（图5C）。经过Image Analyzer软件的分析，98.4%分泌抗CD3的OKT3杂交瘤细胞在JurkatCD3+/CD8-报告细胞中显示出阳性内化信号（图 5D）。仅有1个NanoPen小室（0.74%）包含分泌抗CD8的OKT8细胞被标记为阳性（图5D）。经过进一步评估，这个小室很可能是由于报告细胞漂移导致的假阳性。作为阴性对照，使用不表达CD3或CD8的RajiCD3-/CD8-报告细胞重复内化检测，对于两种杂交瘤都没有得到内化阳性结果（图5C和D）。

图 5 | 三个连续检测的代表性图像。A）来自分泌细胞（白色字体标示的Pen内）的IgG抗体被通道内的珠子捕获，导致荧光信号（绿色）增强。使用与pH敏感的pHrodo染料偶联的抗小鼠Fc特异性Fab片段来检测受体特异性内化，B）使用JurkatCD3+/CD8- 细胞，C）使用RajiCD3-/CD8-细胞。当抗体-Fab复合物被内化并隔离到酸性内体/溶酶体腔室时，可观察到内化试剂的荧光（品红色，pHrodo）（B中的 OKT3 细胞）。D）在 Jurkat 和 Raji 细胞中对抗体内化呈阳性的IgG阳性杂交瘤细胞的定量。

报告细胞系选择

尽管本文未深入讨论，但选择合适的报告细胞系对于开发和成功进行基于细胞的检测至关重要。然而由于抗体发现要求的多样性和报告细胞系表达抗原的差异性，不存在通用解决方案。在执行芯片检测之前评估抗原表达水平和在整个细胞群体内的均匀表达至关重要。抗原表达水平低将导致芯片上荧光“blooming”强度低而难以检测，表达水平高度不均匀则可能会导致假阴性结果。此外，还需要考虑的因素包括细胞导入密度、细胞健康状况、添加避免聚集的物质以及对于贴壁细胞系可能需要的解离步骤。

基于细胞的检测注意事项和展望

本文描述的抗体内化检测极大地扩展了Beacon®平台的能力，使其能够快速、高通量地评估抗体功能。尽管这项工作是高通量量化抗体内化的一个开创性的尝试，但当前工作流程存在一些局限性。它允许对抗体内化进行二元识别；然而，我们尚未证明是否可以用此方法对内化速率或效率进行排名。此外，目前在未经过大量验证和软件优化之前，我们建议使用Image Analyzer软件进行手动分析。我们还注意到，鉴于需要长时间（>1小时）来观察内化，报告细胞在OptoSelect®芯片通道内的小流体漂移可能会改变看似检测结果，因此，我们发现手动查看时间序列图像，能够更准确地识别检测阳性。本文描述的内化检测展示了在开发早期识别有前景的抗体的能力上的重大进步。此外，它为更全面的检测和分析奠定了基础，包括评估内化的程度和速率等。在早期发现阶段以前所未有的规模识别有利的抗体候选物将显著推进ADC的开发。

结 论

Bruker Cellular Analysis提供的Opto® B Discovery工作流程解决方案能够在一天内识别出数千个抗原特异性抗体hits，不仅简化了抗体发现过程，而且显著快于传统发现方法。研究人员利用Beacon®系列单细胞光导系统不仅可以识别具有抗原特异性结合能力的抗体，还能够运行连续检测来评估亲和力、阻断、内吞特性等在内的抗体功能特性。这种在发现阶段早期识别具有所需靶标特异性属性的候选物将极大地加速筛选过程，推进最佳候选抗体进入临床试验。