工作原理：

磷酸化 Rb（Ser807/811）检测原理
磷酸化 Rb（Ser807/811）检测用于测量在 Ser807/811 位点磷酸化的 Rb。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板，不需要凝胶、电泳或转膜。磷酸化 Rb（Ser807/811）检测使用两种标记抗体，一种带有供体荧光团，另一种带有受体。第一种抗体因其对蛋白质上磷酸化基序的特异性结合而被选择，第二种抗体因其能够识别不依赖于其磷酸化状态的蛋白质的能力而被选择。蛋白质磷酸化使得涉及两种标记抗体的免疫复合物形成，这使供体荧光团与受体紧密接近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。其强度与样品中存在的磷酸化蛋白的浓度直接成正比，并在无需洗涤的检测形式下提供了一种评估蛋白质磷酸化状态的方法。

磷酸化 Rb（Ser807/811）双板检测方案：
双板方案涉及在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移到低体积检测板（HTRF 384-lv 或 96-lv 板）中，之后加入 HTRF 磷酸化 Rb（Ser807/811）检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和融合度。 

磷酸化 Rb（Ser807/811）单板检测方案：
使用 HTRF 试剂检测磷酸化 Rb（Ser807/811）可以在一个用于培养、刺激和裂解的单板上进行。无需洗涤步骤。这个为高通量筛选设计的方案能够实现微型化，同时保持强大的 HTRF 质量。 

检测验证：
在 HCT-116 细胞中，CDK4/CDK6 抑制剂帕博西尼（Palbociclib）能有效抑制视网膜母细胞瘤蛋白在 Ser807/811 位点的磷酸化。

HCT-116 细胞以 50 微升的体积接种在 96 孔板中（每孔 50,000 个细胞），使用完全培养基并在 37°C、5% 二氧化碳的条件下孵育。6 小时后，用不断增加浓度的帕博西尼（另外添加 50 微升体积）处理细胞 19 小时。

移除培养基后，用 50 微升的补充裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，然后将 16 微升的裂解物转移到低体积白色微孔板中，再加入 4 微升预混的 HTRF 磷酸化 Rb（Ser807/811）或总 Rb 检测试剂。孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

用Palbociclib（一种细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk4 和 Cdk6）抑制剂）处理会导致视网膜母细胞瘤蛋白在丝氨酸 807/811 位点的磷酸化显著降低，同时该蛋白的总量也会减少（正如 Liu 等人在 2017 年发表于《Plos》的文献中所报道的那样）。

在人和小鼠细胞系上对磷酸化 Rb 细胞检测的验证：
将 NIH 3T3、C2C12 和 HTC116 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种在 96 孔板中。在 37°C、5% 二氧化碳的条件下孵育过夜后，移除细胞培养基，并向细胞中加入 50 微升裂解缓冲液。进行裂解步骤，轻轻振荡 30 分钟。将 16 微升样品转移到 384 孔小体积板中，然后加入三种 HTRF Rb 检测试剂中的每一种各 4 微升。4 小时后记录信号。

两种 HTRF 磷酸化检测方法都与小鼠模型兼容。

使用人HCT116 细胞的磷酸化 Rb Ser807/811 细胞检测，将 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行比较：

人类 HCT116 细胞在 T175 培养瓶中于 5% 二氧化碳、37°C 下培养。当细胞融合度达到 80% 时，裂解细胞并通过离心收集可溶性上清液。对细胞裂解物进行系列稀释，将每种稀释液的 16 微升转移到 384 孔低体积白色微孔板中，最后加入磷酸化 Ser807/811 Rb 细胞检测试剂盒试剂。并行比较显示，HTRF 磷酸化检测至少比蛋白质印迹法灵敏 27 倍。

简化的通路：
细胞分裂周期中的视网膜母细胞瘤蛋白。

110kDa 的视网膜母细胞瘤蛋白 Rb 属于口袋蛋白家族，该家族还包括 p107 和 p130。

Rb 起着肿瘤抑制因子的作用，调节细胞周期进程。

使该蛋白失活的突变会导致视网膜母细胞瘤癌症的发展，在这种情况下，视网膜细胞无法被替换，并受到高水平的致突变紫外线辐射。

在没有有丝分裂信号的情况下，具有活性的低磷酸化 Rb 结合并抑制 E2F 转录因子，而 E2F 转录因子是进入 S 期所必需的。

通过使 E2F 失活，Rb 将细胞维持在 G1 期，阻止细胞周期的进程。

在有丝分裂信号存在的情况下，Rb 被细胞周期蛋白 D-CDK4/6 和细胞周期蛋白 E-CDK2 依次磷酸化并失活。这种磷酸化事件诱导 E2F 转录因子的释放。

最后，E2F 激活诸如细胞周期蛋白、Cdk、胸苷激酶或 PCNA 等基因的转录，这些基因在 DNA 合成和复制以及细胞分裂中起着至关重要的作用。