检测原理：在 HTRF 相互作用检测中，一个部分（直接或间接）用供体标记，另一部分用受体标记（同样直接或间接）。信号强度与两部分的结合成正比。在此处所示的例子中：单克隆抗体 Anti FLAG M2 - XL665 与带 FLAG M2 标签的A部分结合，而B 部分* 与用 HTRF 供体标记的特异性抗体结合。 B部分*也可以是生物素化的、带标签的、Fc 融合的。在这些情况下，使用相应的用供体标记的 HTRF 试剂（抗标签、抗物种、蛋白 A、链霉亲和素）进行检测。

检测方案：右侧的例子描述了使用 20µL 最终检测体积来检测带 FLAG M2 标签的A部分和未带标签的B部分* 之间相互作用的方案。分配两个部分（10µL），孵育，加入单克隆抗体 Anti FLAG M2 - XL665（5µL）和用供体标记的抗B部分（5µL），孵育并读取。* B部分也可以是生物素化的、带标签的、Fc 融合的或直接标记的。在这些情况下，使用相应的用供体标记的 HTRF 试剂（抗标签、抗物种、蛋白 A、链霉亲和素）进行检测。

检测细节：

为特定应用构建 HTRF 相互作用检测：试剂按测试次数（20µL 反应）出售。与 XL665 或 d2 偶联的抗体以每孔 20ng 抗体的量供应。还提供每瓶中的活性部分量（以及每瓶中的示踪剂数量 - 见产品说明表）。活性部分定义为结合物（例如抗体）的活性部分。

测试次数与活性部分的关系：每孔的平均结合物数量反映了总体生物材料含量。通常优选使用活性部分的量而不是总结合物的量。对于穴状化合物和 d2 结合物，总结合物的量等于活性部分的量，因为标记的分子量可以忽略不计。对于用 XL665 标记的实体，总结合物的量将根据 XL665 结合物的最终摩尔比而变化，然而，Revvity 提供的活性部分的量是恒定的，并且基于订购的测试次数。
标记 / 物种抗体活性部分 / 5000 次测试物种和亚型特异性 FLAG® 单克隆抗体 M2 5 - 10µg 小鼠 IgG1 DYKDDDDK 肽。

推荐的穴状化合物和 XL665 结合物的量：穴状化合物结合物不能过量，以防止读数器饱和和不可接受的背景水平。在大多数情况下，1 到 5nM 的穴状化合物浓度是合适的，并且根据所使用的与 HTRF 兼容的读数器，在 620nm 处将产生 20000 到 80000 cps。XL665 结合物必须尽可能与其检测对应物匹配，以便最大数量的生物分子被 XL665 受体标记。因此，要检测浓度为 20nM 的带标签分子，抗标签 - XL665 的浓度应是等摩尔或更高。