高级磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）分析原理：
磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）检测试剂盒用于测量在 Thr202/Tyr204 位点磷酸化的 ERK。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板，不需要凝胶、电泳或转膜。磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体。第一种抗体因其对蛋白质上磷酸化基序的特异性结合而被选择，第二种抗体因其能够识别不依赖于其磷酸化状态的蛋白质的能力而被选择。蛋白质磷酸化使得涉及两种标记抗体的免疫复合物形成，并使供体荧光团靠近受体，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。其强度与样品中磷酸化蛋白的浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质磷酸化状态的方法。

高级磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）双板检测方案：
双板方案涉及在 96 孔板中培养细胞，然后裂解，再将裂解液转移到 384 孔低体积检测板中，然后加入磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和融合度。

高级磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）单板检测方案：
使用 HTRF 试剂检测磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）可以在用于培养、刺激和裂解的单板上进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选设计的方案能够实现微型化，同时保持稳健的 HTRF 质量。

分析验证：

与蛋白质印迹法相比，高级磷酸化 ERK 具有独特的灵敏度。

在 HEK293 细胞培养 48 小时后，用 50nM EGF 刺激 5 分钟。去除培养基并裂解后，收集细胞裂解液并离心 10 分钟。进行系列稀释，并通过蛋白质印迹法和 HTRF 高级磷酸化 ERK 并行分析。使用 HTRF 高级磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）时，仅需 300 个细胞即可检测到最小信号，而蛋白质印迹法则需要 10,000 个细胞才能产生信号。HTRF 高级磷酸化 ERK 检测至少比蛋白质印迹法灵敏 30 倍，并且显示出最佳的相关性。

无需刺激即可对抑制剂的基础磷酸化 ERK 进行剂量反应。

高级磷酸化 ERK 能够研究 MAPK 通路抑制剂化合物在基础激活水平上的作用，无需通路刺激。由于其高交叉反应性，高级磷酸化 ERK 与许多不同的模型物种高度兼容：人、小鼠、大鼠、狗、猴、仓鼠、貂、牛、猪、果蝇和斑马鱼。所有实验均使用贴壁细胞的双板检测方案进行。接种一天后，所有细胞系在 37°C、5% CO₂下用相应的抑制剂处理 30 分钟。

磷酸化 ERK 在糖尿病模型和患者血细胞中的调节

高级磷酸化 ERK 检测试剂盒非常适合监测胰腺 β 细胞系或患者外周血单个核细胞（PBMC）中的激动剂刺激。实验在两种胰腺 β 细胞系 Ins-1E 和 Min6 上进行。使用双板检测方案。两种细胞系均以 70,000 个细胞 / 孔的密度接种 4 天。细胞洗涤后，用不含葡萄糖的 Krebs Ringer 缓冲液孵育。饥饿 2 小时后，用葡萄糖刺激细胞。将 PBMC 以 100,000 个细胞 / 孔的密度分配，然后在 37°C、5% CO₂下用佛波酯（PMA）刺激 30 分钟。

肿瘤异种移植中灵敏的磷酸化 ERK 检测。

从裸鼠中切除 BxPC-3 胰腺肿瘤异种移植组织，研磨并裂解。离心后，收集可溶性部分并进行系列稀释，然后用 HTRF 高级磷酸化 ERK 试剂盒试剂进行检测。

优化用于磷酸化 ERK 检测的细胞密度。

由于高级磷酸化 ERK 的高灵敏度，当预期 ERK 磷酸化水平较高时，建议使用标准细胞系的低细胞密度，以确保在试剂盒的线性范围内操作并实现最佳的信号 / 背景比（S/B）。使用贴壁细胞的双板检测方案，在 HEK293 细胞上用 EGFR 激动剂 EGF 或小分子 Raf 激酶抑制剂 L779 - 450 进行剂量反应实验。细胞以 25,000、50,000 或 100,000 个细胞 / 孔的密度在 37°C、5% CO₂下接种 24 小时。

Gαq/i 偶联受体激活。

使用磷酸化 ERK 细胞检测的双板检测方案，在 CHO - CCR5（25,000 个细胞）上用 Rantes 和 MIP - Iß 激活 10 分钟获得的结果。

筛选鲁棒性。

在室温下用卡巴胆碱刺激 CHO - M1（5,000 个细胞 / 孔 - 384 孔小体积板）10 分钟。在五十次重复实验中，计算未刺激细胞（基础水平）和两个选定的卡巴胆碱浓度（1.3μM 和 4μM，分别对应于 EC80 和 EC100）之间的 Z' 值。使用磷酸化 ERK 试剂盒的单板检测方案在来自 CyBio™的机器人系统（配备 384/25μL 移液头的 CyBivario）上进行检测。结果在 PHERAStar Plus（BMG Labtech）上读取。

总 ERK1/2 检测以控制 ERK1/2 的磷酸化。

使用磷酸化 ERK1/2 和总 ERK1/2 检测的双板检测方案，用 EGF 激活 A431 细胞（100,000 个细胞 / 孔）10 分钟。正如预期的那样，结果显示在 EGF 刺激下 ERK1/2 磷酸化呈剂量反应性增加，而 ERK1/2 表达水平保持恒定。

简化的通路：

MAPK/ERK 细胞信号通路：

MAPK/ERK 信号级联由参与生长和分化的多种受体激活。核心信号转导级联引发众多细胞过程的调节，包括粘附、迁移、凋亡、分化和代谢。MEK1/2 在 Tyr204 和 Thr202 位点催化 ERK1/2 的磷酸化。作为响应，ERK 磷酸化数百种细胞质和核底物。MAPK 信号的广泛复杂性和多样性使 ERK 成为生物学中的关键调节因子和主要信号节点。

ERK 在 GPCR 信号通路中的作用：
ERK 调节在 GPCR 信号通路中起着重要作用，因此是一个重要的可测量的 GPCR 读出指标。GPCR 通过 G 蛋白作用调节广泛的细胞功能。在刺激下，这些受体激活效应器如腺苷酸环化酶和磷脂酶 C，这不仅影响细胞内第二信使如 cAMP 和 Ca²⁺的浓度，还介导 ERK1/2 磷酸化。GPCR 也已被证明以不依赖 G 蛋白但依赖 β-arrestin 的方式介导 ERK1/2 激活。