工作原理：
总 cRaf 检测原理：
总 cRaf 检测用于量化细胞裂解物中 cRaf 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板，不需要凝胶、电泳或转膜。总 cRaf 检测使用两种标记抗体，一种与供体荧光团偶联，另一种与受体偶联。这两种抗体对蛋白质上不同的表位具有高度特异性。在细胞提取物中存在 eNOS 的情况下，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体紧密接近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。其强度与样品中存在的蛋白质浓度直接成正比，并在无需洗涤的检测形式下提供了一种评估蛋白质表达的方法。

总 cRaf 双板检测方案：
双板方案涉及在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解。接着将裂解物转移到 384 孔低体积检测板中，之后加入 HTRF 总 cRaf 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和融合度。

总 cRaf 单板检测方案：
使用 HTRF 试剂检测总 eNOS 可以在一个用于培养、刺激和裂解的单板上进行。无需洗涤步骤。这个为高通量筛选设计的方案能够实现微型化，同时保持强大的 HTRF 质量。

检测验证：
在 TPA 刺激的 HeLa 细胞中检测总 c-RAF 和磷酸化 c-RAF（S43）：
HeLa 细胞以 100 微升的体积接种在 96 孔板中（每孔 100,000 个细胞），使用完全培养基并在 37°C、5% 二氧化碳的条件下孵育过夜。第二天，移除培养基，加入 50 微升无血清培养基，在 37°C、5% 二氧化碳的条件下使细胞饥饿 5 小时。然后用 50 微升不断增加浓度的 TPA 在 37°C、5% 二氧化碳的条件下处理细胞 15 分钟。

移除培养基后，用 50 微升补充裂解缓冲液 #2 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，然后将 16 微升裂解物转移到低体积白色微孔板中，再加入 4 微升预混的 HTRF 磷酸化 cRaf（Ser43）或总 cRaf 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

在 TPA 刺激的 HEK293T 细胞中检测总 c-RAF 和磷酸化 c-RAF（S43）：
HEK293T 细胞以 100 微升的体积接种在 96 孔板中（每孔 100,000 个细胞），使用完全培养基并在 37°C、5% 二氧化碳的条件下孵育过夜。第二天，移除培养基，加入 50 微升无血清培养基，在 37°C、5% 二氧化碳的条件下使细胞饥饿 5 小时。然后用 50 微升不断增加浓度的 TPA 在 37°C、5% 二氧化碳的条件下处理细胞 15 分钟。

移除培养基后，用 50 微升补充裂解缓冲液 #2 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，然后将 16 微升裂解物转移到低体积白色微孔板中，再加入 4 微升预混的 HTRF 磷酸化 cRaf（Ser43）或总 cRaf 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

简化的通路：
RSK1 的功能和调节：
RAF 原癌基因丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶（c-RAF）是 MAP 激酶通路的一部分，它将上游效应物 Ras 与下游 MAPK/ERK 级联连接起来。因此，它在包括增殖、分化、凋亡、存活和致癌转化在内的细胞命运决定中发挥作用。

c-RAF 通过 PKC 的直接或间接作用在 Ser338 位点磷酸化而被激活，或者通过与 GTP 结合的 Ras 直接激活。通过 MAPK/ERK 依赖性反馈在 Ser43 位点磷酸化确保其失活。