抗体纯化四部曲

随着细胞培养工艺灌流和连续流工艺革新和改进，抗体产量从每升几百mg提高到5-10g甚至更高到50g/L以上，大规模抗体生产的“瓶颈”和生产成本逐渐从抗体表达转移到了抗体纯化，因此对提高纯化通量和效率，降低成本的需求越来越大，成为抗体生产工艺研究的一个重点。

提高抗体纯化效率一方面可以通过优化现有纯化工艺设备、方法和工艺，挖掘现有纯化技术的潜力。另一方面则可以通过开发创新性的介质和工艺，从根本上突破现有技术障碍。

抗体分离纯化的主要目的是将抗体与工艺相关杂质和产品相关杂质分离，终获得高纯度、低潜在危害的抗体药物。

纯化过程中需要去除的工艺相关杂质包括细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸及培养基与加料液成分，需去除的产品相关杂质主要包括抗体片段和聚集体。纯化过程还需具备足够的病毒灭活去除能力，以去除宿主细胞自身表达的内源病毒样颗粒和未及时发现的外源病毒。

大多数工艺利用ProteinA来捕获抗体，并利用了至少1个离子交换层析作为精纯步骤，仅少数工艺使用了疏水、羟基磷灰石和分子筛层析等步骤。

图1中显示了一个常见的抗体纯化工艺。反应器收获液首先经过离心和过滤，去除细胞和细胞碎片，然后经过ProteinA层析捕获抗体,捕获后的抗体经低pH孵育后，通过两个离子交换层析进行精纯,然后进行病毒过滤，后换液并调整抗体浓度，得到抗体原液。

工艺中的低pH孵育和病毒过滤是两个正交的专属病毒去除灭活步骤。这两个专属步骤与层析步骤一起，可大大降低原液中可能存在的病毒数目。

图1 抗体纯化工艺流程

抗体为胞外分泌型表达，纯化的步是将培养液上清与细胞及细胞碎片分离开来。在实验室规模，分离可通过简单批次离心完成，但大规模抗体生产主要采用连续分离的方法，主要包括深层过滤、切向流过滤和连续流离心。

深层过滤的优点是简单易用，前期投入低。深层过滤介质的孔径分布较广，内表面积大，可依靠孔径截留和内表面吸附双重作用去除固体颗粒，比单一孔径滤器能处理更大量的固体杂质，且流速更快。

深层过滤系统由一系列的滤器组成，介质的孔径从上游到下游递减（见图2）。深层过滤本身不能达到无菌过滤，所以过滤系统的后一级通常需要一个无菌滤器。深层过滤介质中含有硅藻土，硅藻土在抗体纯化条件下带正电荷，在去除细胞和细胞碎片的情况下，还可以去除部分带负电荷的宿主细胞核酸和宿主细胞蛋白质，起到初步纯化的作用。

深层过滤的缺陷是一次性滤芯使用费用高和处理量有限，在处理大体积培养液时需并联多个滤器，费用和占地面积显著增加，所以深层过滤的试用范围限于100-2000L的中试规模的抗体纯化。

图2 深层过滤系统切面图

切向流滤器在灌流反应器部分较为常用（见图3），其高切向的流速可减少细胞在膜表面的沉积，从而可以处理大体积细胞培养液而不造成膜的堵塞。

切向流的流速越高，细胞沉积越少，但同时带来的剪切力越高，细胞破碎风险越大。细胞破碎形成的细胞碎片更容易阻塞滤芯，并且细胞破碎释放的胞内蛋白和核酸将大大增加后续纯化步骤的压力。

切向流滤器的使用以中空纤维为普遍，其表面积大，又可以在孔腔内形成高剪切力。中空纤维滤器的工艺放大可通过增加纤维数目完成，简单易行。

在切向流过滤工艺开发和优化方面，需要考虑的包括滤芯化学成分、滤芯表面积、孔径、切向流流速、跨膜压力。

切向流过滤存在死体积，可在过滤后期加人少量缓冲液，降低死体积中的抗体含量，减少抗体损失。切向流过滤处理量大，可用于超过10000L细胞培养的分离，达到每小时近5000L的液体处理量。其局限在于滤器费用较高，过滤时间较长，并且过滤速度的可控性低。

图3 切向流滤器切面图

连续流离心，尤其是采用碟片式离心机进行的连续流离心，是大规模抗体生产中主要采用的分离模式。

碟片式离心机腔体为锥形，细胞培养收获液在靠近轴部加入，离心后上清液从轴部附近排出，细胞在离心力作用下，在锥形的底部边线附近聚集结块。

腔体定期在细胞聚集处轻微开启，利用腔体内的压力将细胞排出。细胞排出夹带的液体损失可通过离心力（转速）、腔体开启频率和开启时间的优化，控制在5%以下。

连续流离心能够去除大部分细胞和细胞碎片。残留的少量细胞碎片可用深层过滤去除。碟片式离心机的优点是体积小，多层碟片形成的沉降面积大，液体处理量大，操作简单、可靠，使用费用低。其缺点是前期设备投资髙，清洗较复杂，并缺少合适的小试模型。

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