得益于高特异性与低毒性，抗体药物在过去十年内快速增长，并已成为目前世界上最为畅销的治疗药物，例如Pembrolizumab和Adalimumab。这些单克隆抗体药物都是根据经典的抗体结构开发而来，并在它们的两个抗原结合位点上拥有相同的重链和轻链可变区域。而随着抗体工程技术的进步，一种新型的被称为双特异性抗体（bsAbs）的抗体治疗药物油然而生。它们被设计成拥有着两个截然不同的抗原结合位点，可以同时结合住两种不同细胞上表达的两种不同的抗原。这种双抗能够将两种细胞聚集在一起，从而起到治疗的作用。例如靶向细胞毒性细胞上的受体和肿瘤细胞上的受体的双抗可以将细胞毒性细胞带到肿瘤细胞附近，从而更快地杀死肿瘤细胞。再或者一些双抗可以同时结合并干扰两种不同的受体-配体相互作用，从而更有效地阻断增殖以及血管生成的相关通路。目前已有多种双抗药物获批上市，如Blinatumomab（于2015年获批）和Emicizumab（于2018年获批）。而随着更多的双抗用于治疗，拥有一种可以快速准确评估和表征这些双抗药物稳定性的方法便非常必要。而Revvity所拥有的两种均相免洗方法（HTRF与Alpha）都能够高通量地表征双抗与两种靶蛋白的结合能力与特异性，完美助力双抗药物的研发。本文将会从这两个方法入手，通过对应的案例，为大家介绍如何运用HTRF与Alpha技术建立表征双抗结合性能的检测方法。
方法一 —— HTRF
HTRF全称Homogeneous Time Resolved Fluorescence，是一种免洗的时间分辨能量共振转移技术。HTRF 测定法通过将一个供体荧光素（长寿命荧光）或一个受体荧光素（短寿命荧光）各自耦合到两个生物分子上从而来评估这两个生物分子的相互作用。当这两个生物分子靠得足够近时，通过运用320nm光源激发供体荧光素后，便能测得两种荧光染料之间的能量转移，并且受体荧光素的665nm荧光强度与相互作用的生物分子数量成正比。而将此技术运用在双抗上时，我们会使供体荧光素和受体荧光素各自与其中一种抗原蛋白相结合。当在检测体系中存在可以同时结合这两种抗原蛋白的双抗时，便能够将这两种抗原蛋白聚集到一起，并在激发下形成能量共振转移（如图一）。接下来，我们将以anti-CD200/CD47鼠双抗为案例，讲解运用HTRF技术来建立/优化表征双抗结合性能的检测方法。
图一
第一步：确认原材料
在建立方法之前，我们首先需要确定实验所需的材料。例如我们需要确保带了标签的重组蛋白能够同时被抗此蛋白的双抗以及抗标签的抗体同时识别；再例如我们需要找出合适的结合缓冲液从而确保双抗能够正确地识别到抗原蛋白。因此在进行方法建立之前，我们需要预先进行一些先行试验，从而找出最为合适的原材料。在我们的案例中，为了建立表征anti-CD200/CD47 鼠双抗，最终选择了带His标签的鼠CD47 (His-mCD47) 与标记了生物素的鼠CD200 (bio-mCD200) 作为两个抗原蛋白。
第二步：供体/受体配对优化
在确定了使用带His标签的CD47与生物素标记的CD200后，我们便有多种供体/受体配对可供选择。而在此案例中，开发者将范围缩小至使用Eu作为供体，d2作为受体。因此仅剩下两种配对可供选择：
Anti-6His-Eu Cryptate (Anti-His-Eu) & Strepatavidin-d2 (SA-d2)
Streptavidin-Europium Cryptate (SA-Eu) & Anti-6His-d2 (anti-His-d2)
虽然供体染料和受体染料都已确定，但是不同的标签-染料配对依旧会有不同的效果，因此我们需要通过实验来找出最为合适的一对配对。具体的实验方案如图二。
图二
在这个检测体系中，共有五个生物分子参与反应。其中双抗的终浓度已通过预先实验确定为2nM；供体与受体染料的终浓度以说明书要求为基准进行稀释；而两个抗原蛋白则选择了三个浓度点（5, 2, 1和0nM）进行实验。详细的实验结果请参考图三。通过实验我们可以得出结论：Anti-His-Eu与SA-d2的配对可以得到最高的信噪比。因此我们将使用此配对进行后续的方法建立与优化。
图三
第三步：抗原蛋白浓度优化
在完成了抗体配对优化以后，我们便可以通过使用更大浓度范围的抗原蛋白交叉滴定实验从而得出此方法中最优的抗原蛋白浓度配对。在此案例中，每个抗原蛋白设置了八个浓度点：从最高20nM进行对半稀释，一直到稀释到最低0.3125nM，并加上一个0nM浓度点作为对照进行了实验。从图四的结果可以看到，当bio-mCD200的浓度高于15nM的时候就会达到平台期，而当His-mCD47浓度高于2.5nM的时候就会出现Hook反应。因此他们最终选择了15nM作为bio-mCD200的终浓度，2.5nM作为His-mCD47的终浓度。
图四
第四步：方法的验证
在确定了合适的供体/受体配对以及最佳的抗原浓度对后，此表征双抗结合性能的HTRF检测方法便基本优化完毕。最终我们可以进行一个双抗的浓度滴定实验与一个使用不带标签的抗原蛋白作为抑制剂的特异性实验进行验证。案例中的方法验证结果如图五。可以看到，随着双抗浓度的增加，HTRF的信号也随之增加；而随着不带标签的抗原蛋白浓度增加，HTRF的信号也随之减弱。这便意味着，此方法可以有效检测出此双抗对于两个抗原蛋白的结合性能。
图五
到此为止，案例中针对anti-CD200/CD47鼠双抗抗原结合性能检测的HTRF方法便建立成功。由此可见，只要找到了合适的原材料，仅需通过几个实验，一个高通量、稳定、灵敏的表征双抗结合性能的HTRF检测方法便可轻松完成开发。
方法二 —— Alpha
与HTRF类似，Alpha技术也是一种快速、高灵敏、均相、免洗、可在微孔板中进行检测的技术平台。Alpha实验也需要供体微珠与受体微珠与靶点进行结合。不同处在于，在680 nm光源的激发下，供体微珠产生的是单态氧，其在溶液中能够扩散大约200nm的距离。如果受体微珠距离供体微珠足够接近，便能够接收到单态氧，形成能量转移，并发射出615 nm的信号，反之便不会有信号产生。因此相对于HTRF，Alpha技术能够运用在一些更为复杂构象的蛋白互作检测中，并能够很好地耐受机制带来的影响。而将此技术运用在双抗上时，整个检测的模型也与HTRF类似。如图六，我们会将供体微珠与受体微珠各自与其中一种抗原蛋白相结合。当在检测体系中存在可以同时结合这两种抗原蛋白的双抗时，便能够将这两种抗原蛋白聚集到一起，并在激发下形成能量共振转移。
图六
而具体的方法建立也与HTRF类似，需要总共四个步骤，分别为：原材料的确认、供体微珠/受体微珠配对的优化、两个抗原蛋白浓度的优化以及最终方法的验证。具体到优化步骤此文便不再赘述。
但除了这种经典的双抗检测模型外，Alpha还可以提供一种能够在单个检测孔中同时检测双抗与两个抗原蛋白各自的结合特性的检测方法，便是我们Revvity的AlphaPlex检测技术。此方法是建立在我们Alpha技术的基础上，通过使用两种Alpha受体微珠（散发545nM信号的AlphaPlex微珠与散发615nM信号的AlphaLISA微珠），从而达到在单孔中同时检测两个蛋白的目的。在双抗检测的运用上，具体的模型如图七。其中两个抗原蛋白分别用两种Alpha受体微珠进行捕获，而双抗自己则在与两个抗原蛋白互作的基础上再通过Alpha供体微珠进行识别，从而形成可以同时检测双抗两个抗原结合位点的结构。而此方法的优化也与先前的方法类似，只需确定合适的材料并进行抗原蛋白的浓度优化，便能快速完成方法的建立。
图七
Conclusion
通过运用Revvity的HTRF与Alpha技术，我们可以快速设计并建立一个均相、免洗、高通量的表征双抗与抗原结合性能的检测方法，并运用在双抗开发与生产的各个阶段：如开发初期的双抗高通量筛选；开发中期的双抗在各个机制与条件下的稳定性测试；以及在生产质检环节的各批次双抗性能差异验证。除此之外，通过Alpha的Multiplexing技术，还能够省时省力省样品地同时检测双抗与两个抗原蛋白各自的结合性能。由此可见，HTRF与Alpha技术是双抗药物研发的不二之选！
