IVIS活体成像应用聚焦——外泌体研究

外泌体（Exosomes），是由活细胞分泌的一种脂质双分子结构的胞外小泡（EV， Extracellular Vesicles），直径约为30-150nm，广泛存在于血液、唾液、尿液、脑脊液、精液、乳汁、羊水、肺泡灌洗液以及其他生物体液中。外泌体携带有多种蛋白质、脂类、RNA等重要信息，不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，更有望成为多种疾病的早期诊断标志物，或者作为药物的天然载体用于治疗。本文将为大家介绍如何运用活体成像技术进行外泌体相关内容的研究。

一，外泌体示踪

图1 外泌体（EVs）的获取和标记

目前针对外泌体（EVs）的分离和纯化已经有很多可选的成熟方法，针对其应用和药物开发也有大量的研究结果。那么，如何在不影响其生物分布的情况下，在体内示踪EVs是其作为药物传递载体和治疗药物成功开发的关键。本研究借助影像学方法，分别评估了五种不同的光学和核示踪剂标记方法对EVs体内生物分布的影响。

图2 荧光（mCherry、DIR）标记EVs的小鼠活体成像图像

研究人员选用小动物活体成像系统评估了荧光和生物发光标记EVs在动物体内的分布情况。使用荧光蛋白mCherry和荧光染料DIR标记EVs，通过活体图像（2A、2E）、离体图像（2B、2F）以及离体组织和组织裂解液荧光信号（2C、2D、2G、2H）的比较，可以清楚看到DIR标记的EVs在体内的生物分布情况，而mCherry标记的EVs受到动物组织高水平背景荧光的限制，与PBS空白对照组没有形成明显的分布差异，因而不适用于EVs的体内示踪。

图3 生物发光（Nanoluc）标记EVs的小鼠活体成像图像

之后，研究人员选用了Nanoluc作为生物发光示踪剂，用于EVs的体内监测。然而，由于Nanoluc产生的短波长不容易穿透动物组织，使得活体动物深层器官（包括肝脏，脾脏和肺）的成像受到了限制，Nanoluc标记的EVs在活体（3A）和离体（3B、C、D）水平表现出不同的生物分布。同时，对EVs的基因修饰会导致其表面蛋白组成发生变化，影响其自身生理和生物分布，表明转基因融合标记的方法（NanoLuc、Firefly、mCherry）并不适用于标记EVs。本研究通过一系列体内和体外影像检测，发现DiR和放射性标记是EVs体内成像最敏感的示踪剂。

二，外泌体载药

图4 纳米电穿孔芯片制备包载核酸的外泌体

外泌体作为一种内源性的天然运载体，近年来备受青睐，成为体内核酸药物运输的一种新型工具。本研究开发了一种细胞纳米穿孔方法，用于生产含有治疗性mRNA和靶向肽的大量外泌体。相比传统的脂质体转染或电转，产生包载大片段基因（6-9kb）的外泌体数量能够提升50倍左右。该方法具有普适性，经验证可在多种类型的细胞中显著提高外泌体产率。

图5 外泌体在小鼠体内的靶向分布图像

生产出外泌体之后，需要对其作为药物载体的靶向效果进行验证。研究人员使用PTEN基因缺失的人源脑胶质瘤细胞系U87建立小鼠原位脑肿瘤模型，给予包载PTEN mRNA的外泌体，该外泌体经转基因编辑靶向肽以增强其靶向性（Exo-T），并用亲脂质型的荧光探针PKH26进行染色。利用小动物活体成像系统，研究人员对脑胶质瘤在小鼠体内的生长情况以及荧光标记的外泌体在小鼠体内的分布情况进行了监测。结果显示，与PBS空白对照、传统的载药载体阳离子脂质体（Turbo）以及未经靶向改造的外泌体组(Exosome)对比，尾静脉注射4小时后，两组外泌体均有明显的脑靶向，而加了靶向肽的外泌体则能够更好的富集到小鼠脑部。离体组织成像及荧光定量分析均证实了该结果（图5）。

图6 包载PTEN mRNA的外泌体抑瘤效果评价

利用肿瘤细胞携带的萤光素酶报告基因，研究人员同时监测了肿瘤的生长情况，以完成对不同处理组的药效学评价。结果显示，经过靶向性改良的载药外泌体具有显著的抑瘤效果，并且一次给药可以抑制肿瘤生长12天左右（图6）。该系统的研发将有助于核酸药物载体在临床上的开发应用。