IVIS视角丨啥，发光荧光素酶也能多色拍照？

作者:周周

来源：瑞孚迪生命科学

生物发光成像（Bioluminescence imaging，BLI）已成为临床前和非侵入性体内生物事件研究中广泛采用的技术。生物发光的产生依赖于荧光素酶催化的荧光素底物氧化，为了限制体内组织成分的光吸收，多选择发光波段在“生物光学窗口”（ 600 nm-800 nm）的红移荧光素酶，以提高BLI的敏感性，并实现在深层组织中随时间跟踪单个细胞。然而，由于目前的BLI产品有限，很多实验只能使用单个荧光素酶，即使标记多个荧光素酶，也要通过不同底物进行顺序成像，这给实验数据的解释带来新的挑战。

IVIS具有独家的光谱拆分技术，可以通过硬件、软件和专利的光谱拆分技术完美的实现同一个实验多色荧光标记，以提高数据的科学性，扩展客户更多的实验可能。这项技术不仅仅是针对可以灵活标记的荧光成像，对需要同时检测的多色生物发光也一样表现优秀。双色生物发光光谱拆分成像

采用新的甲虫荧光素酶突变体CBG2和BCR2用于体内双色近红外 (NIR) BLI[1]。将不同比例稳转细胞HEK-CBG2和HEK-CBR2尾静脉注射小鼠，构建肺癌模型，注射底物NH2-NpLH2后采用IVIS活体成像系统进行成像，软件设置540 nm到800 nm滤光片，通过光谱拆分同时获得HEK-CBG2和HEK-CBR2发光信号的图像（图1）。IVIS活体成像系统可以实现在单一荧光素酶底物下一次实验测量多个生物学过程。

图1：CBG2和CBR2突变体不同比例混合后的体内光谱拆分图像和光谱特性。

多色生物发光光谱拆分成像

利用AI驱动的de novo蛋白质设计并创建比天然荧光素酶性能更加优越的新一代荧光素酶neoLux（图2）[2]。相比传统的自然或工程化荧光素酶，具有尺寸紧凑、稳定性强、细胞表达高效、催化效率更高和底物特异性更强等特性，是荧光素酶改造的重大进步。在NGS小鼠体内不同位置注射表达不同荧光素酶的细胞 (Hela-neoLux1.2、luxNeon、luxGold、luxKOk 、luxOFP和luxKate) 和不同比例混合的细胞，模拟癌症的异质性（图3）。IVIS活体成像系统进行拍照并进行光谱拆分，可以同时得到表达不同荧光素酶的图像。IVIS成像不仅能在细胞和体内进行多参数成像，还可以对体内癌症异质性进行多色跟踪，为复杂的生物学发现铺平了道路。

图2：De novo新一代荧光素酶变体neoLux1.2、luxNeon、luxGold、luxKOk 、luxOFP和luxKate发光图片和光谱特性。

图3：新一代荧光素酶变体不同细胞和不同比列混合后体内光谱拆分图像。

基于BRET红移的多色生物成像

一些工程化荧光素酶如NanoLuc:furimazine的光谱发射主要局限于短波长蓝光，这限制了其在体内BLI应用。基于生物发光共振能量转移 (BRET) 可以实现体内红移成像和同一底物下多色发光成像[3]。通过构建不同稳转细胞株，进行BRET融合蛋白的体外细胞成像，采用IVIS生物发光模式，光谱拆分进行多通道成像(图4)。值得注意的是，GpNLuc和GeNL两个BRET融合蛋白发射光谱只有8 nm区别，但同样实现了高效的光谱分离。

基于IVIS仪器的强大光谱拆分能力，进一步选择GpNLuc/YeNL/OeNL绿、黄、橘三色融合蛋白的稳转肿瘤细胞株，按不同比例混合后，进行体内皮下瘤模型构建和验证（图5），同样可以很好的获得不同标记细胞的发光信号。

图4：工程化BRET融合蛋白发光图谱和细胞体外发光图像。

图5：分别表达GpNLuc/YeNL/OeNL融合蛋白的稳转肿瘤细胞皮下移植示意图和多色光谱拆分图。

肿瘤的发生和发展是一个复杂的、多参数的生物学过程，需要进行细胞类型区分和信号通路之间的相互作用和串扰的验证。利用IVIS成像系统强大的BLI光谱拆分技术，可以将这一复杂过程可视化，为肿瘤研究提供一个强有力的新型工具，并帮助科研工作者更好地了解这种疾病的机制。

瑞孚迪（Revvity）公司IVIS产品系列具有独家的光谱拆分技术，通过专利的光谱拆分算法，将不同波段下获取的原始图像进行分析和处理，得到不同信号的图像并进行信号融合分析，实现在同一实验中多色灵活标记，极大的扩展了客户的实验需求。通过此技术发表的高分文献已达上千篇，涵盖生命医学领域的各种不同应用。