最新发布｜Beacon®单细胞功能表征平台为细胞疗法开发提供创新工具

Beacon®单细胞光导系统不仅在抗体发现和细胞株开发领域已经得到了国内外工业和学术客户的认可，在针对T细胞的单细胞功能表征的应用中也有越来越多的新研究成果发布。近期，布鲁克细胞分析将陆续发布四份应用指南，与大家分享和探讨Beacon®的T细胞功能表征应用在新型细胞疗法的发现、验证和转化研究阶段的应用。本期内容将带大家再次认识Beacon®技术和提供的T细胞表型和功能的多维分析方法。

过继细胞疗法（ACT）通过对⾃体或同种异体免疫细胞的工程化改造和移植，为正在进行的抗癌⽃争带来了新的治疗希望[1,2]。成功开发过继细胞疗法需要在开发过程的不同阶段面临多种挑战（图1）。在发现阶段，对CAR/TCR和抗原进行探索，以确定能够提供针对癌细胞的有效靶向方式和有功效的候选药物。之后的验证阶段需要对CAR-T或TCR-T进行严格评估以验证其性能。最后的转化阶段包括在临床试验中测试有前途的候选药物，以优化治疗并评估对患者的治疗影响。

图1.细胞疗法开发不同阶段的目标与挑战

接下来我们将展示布鲁克的Beacon®单细胞光导平台如何利用尖端光流控技术和OptoSelect芯⽚上的NanoPen纳升级小室来实现单细胞功能表征，从表型、功能（细胞因子分泌和细胞毒性）和序列等多个维度为细胞疗法开发提供创新工具。

Beacon®单细胞光导平台和工作流程

Beacon®整合了精密调控的流路系统、细胞培养系统、显微镜、明场和荧光成像和AI图像算法等功能，能够用于操作和培养加载到OptoSelect芯⽚上的细胞。Beacon®平台上的软件算法可以根据芯⽚通道中的细胞或者微珠的大小、形态和荧光来进行有效识别，并⾃动将它们加载到每个芯⽚上的NanoPen小室中（图2）。通过明场和荧光滤光⽚进行延时成像使，研究⼈员能够深入表征数千个单细胞的功能特征。Beacon®能够根据筛选条件⾃动导出具有特定功能的细胞，以用于开展测序等下游分析。与其他依赖液滴或微孔的单细胞技术相比，Beacon®在细胞的连续培养和表征上具备明显优势：流路系统让新鲜培养基持续注入到NanoPen上方的通道中，从⽽允许氧⽓、营养物和细胞代谢废物通过浓度梯度扩散进行有效交换，让细胞维持在健康生理状态下完成多种检测和长时间的追踪（图2）。

图2. Beacon®系统和OptoSelect芯片上工作流程

动态单细胞层面细胞毒性测定

针对肿瘤靶细胞的细胞毒性是CD8+ T细胞的关键功能标志。使用传统的细胞毒性检测，例如铬释放测定或活/死细胞染⾊法等仅测量固定时间点的平均细胞杀伤率[6]。在单细胞⽔平上检测细胞毒性可更细致地了解T细胞功能异质性。这种在单细胞分辨率下的动态追踪将解释细胞毒性的动⼒学，能够展⽰不同的细胞杀伤行为，例如快速杀伤的迅速响应的和慢速杀伤的持续作用（图3）。把这些数据与临床特征联系起来，将有助于我们加深对于过继细胞疗法复杂动态特征的理解。

图3. Beacon®上开展单细胞层面细胞毒性分析

单细胞多重细胞因⼦分泌测定

单细胞层面细胞因⼦的功能性分泌已被证明是癌症免疫治疗疗效的有效预测因⼦[7-9]。Beacon®能够检测三种客户自定义的细胞因子。布鲁克的IsoSpark/ IsoLight单细胞功能蛋白质组学分析平台能够提供30+种细胞因⼦分泌分析，可帮助识别驱动细胞功能的关键细胞因⼦[10]。Beacon®平台可将⼀组微珠加载到NanoPen室中以捕获活细胞分泌出的细胞因⼦。然后在NanoPen室中导入单个T细胞和靶细胞或刺激物（如CD3/ CD28微珠）。经过过夜的孵育后，使用⼆抗在芯⽚上处理微珠，并利用不同荧光通道的图像捕获以直接揭⽰单个T细胞的细胞因⼦分泌⽔平（图4）。通过检测T细胞在特定刺激下的单细胞分泌为研究者提供有探索价值的数据，并为了解功能性细胞因⼦分泌的机制创造了机会。

图4. Beacon®上开展T细胞三重细胞因子分泌测定

基于细胞表⾯标志物的表型测定

Beacon®可利用荧光来检测T细胞或靶细胞上是否表达特异表⾯标志物，用于选择性导入目标细胞导或对导入后的细胞分析其表面标志物（图5）。仪器能够选择性地将特定表型细胞加载到NanoPen室中。光流控技术直接在NanoPen室中设置细胞进行功能测定，与FACS和其他细胞分选技术相比，需要更少的细胞。相比于FACS使细胞承受⾼流速和剪切应⼒[11]，光流控技术依赖于将光照射在芯⽚上产生电场来轻轻推动细胞，减少细胞受损。细胞导入后，还可以在细胞毒性和细胞因⼦测定过程中进行表⾯标志物染⾊，以提供有关表⾯表型的附加数据。例如，CD69或CD137染⾊可揭⽰具有细胞功能的细胞激活。相似地，可对细胞耗竭、持久性或共刺激等标志物进行染⾊。

图5. Beacon®用于细胞表面标志物和表型分析

整合多维分析结果，全⾯了解单细胞功能

Beacon®可以同时进行三重细胞因⼦分泌、细胞毒性和表⾯标志物测定。对同⼀单细胞进行所有三种测定揭⽰了功能之间的复杂关系，这是使用传统方法⽆法获得的：通过分析细胞因⼦分泌和细胞毒性，揭⽰细胞杀伤是否与所分析的细胞因⼦相关。添加表⾯标志物分析将激活或耗竭等变量与杀伤潜⼒和细胞因⼦分泌联系起来。将Beacon®平台生成数据用于创建多维可视化，区分具有不同功能特征的细胞群（图6）。探索细胞群体的功能异质性揭⽰对细胞行为的深入见解，这将为理解ACT性能的提供关键信息。

图6. 根据细胞功能特征进行分群

细胞导出和下游分析

Beacon®平台对活细胞进行后，研究者可以找到值得进⼀步研究的细胞。利用光将NanoPen室中找到感兴趣的细胞并将其导出到96孔板中。然后可以使用多种技术（例如TCR-seq或scRNA-seq）对细胞进行分析，以揭⽰细胞的TCR或转录组图谱（图7）。这些多组学见解直接揭⽰了单细胞⽔平上细胞功能的基因组和转录组驱动因素[12]。成功利用Beacon®平台的导出功能可以深入了解为什么某些细胞比其他细胞功能更强，从⽽识别关键机制，加速对癌症免疫疗法的理解和开发。

图7. Beacon®上目标细胞回收

更多检测

除了以上的分析方法，利用Beacon®的单细胞培养和延时拍照，研究者还能够对NanoPen室中细胞的数量进行计数追踪，以分析细胞增殖能⼒。将多个靶细胞与T细胞⼀起导入NanoPen室中，则可以揭⽰T细胞是否具有连续杀死多个靶细胞的能力。计算靶细胞和T细胞之间的距离可用于生成有关运动、趋化性和突触形成的数据。Beacon®平台的灵活性为研究⼈员提供了⽆与伦比的工具来实时监测和分析活的单细胞。