高通量筛选下，植物基因检测新方法如何“发光”发热？

随着生物技术的不断发展，转基因植物在农业、医药、环保等领域的应用越来越广泛。通过转基因技术可以帮助科学家更好的理解植物或农作物的生物学功能验证。然而，如何准确、快速地检测转基因植物中的外源基因表达和功能，一直是科学家们面临的挑战。传统的转基因检测方法如PCR、Southern blot、Northern blot等，虽然具有一定的准确性和可靠性，但也存在着操作复杂、耗时耗力、灵敏度低等缺点。因此，建立操作简便、直接从目的蛋白表达量筛选高表达转基因植株一直是植物分子生物学家要解决的技术难题。

荧光素酶报告基因技术作为一种新型的转基因检测方法，具有操作简便、灵敏度高、实时监测等优点，一直是转基因研究中的重要手段。荧光素酶是一种能够催化荧光素氧化并产生生物发光的酶。在转基因植物中，将荧光素酶基因与目标基因的启动子或其他调控元件连接，构建成报告基因载体。当目标基因表达时，荧光素酶也会随之表达。通过加入荧光素底物，可以检测到荧光素酶产生的生物发光信号，从而间接反映目标基因的表达水平。

图1：荧光素酶报告基因工作原理

近日，日本的研究团队开发了一种名为Lumi-Map的高通量平台，该平台结合了基于孔板的荧光素酶 (LUC) 报告基因检测和突变图谱 (MutMap) 的技术，实现了对突变体的高效筛选和基因功能的快速鉴定，为我们揭示了拟南芥中参与病原体相关分子模式 (PAMP) 触发免疫的基因。这一研究成果不仅为植物免疫机制的研究提供了新的思路，也为荧光素酶报告基因技术在转基因植物中的应用提供了成功的范例。

图2：Lumi-Map方法的示意图。用甲基磺酸乙酯 (EMS) 诱变WRKY29报告菌株（W29-1-4），获得M2后代获得的。通过flg22处理的M2幼苗的生物发光监测进行突变体筛选。PTI=病原体相关分子模式触发免疫。将表现出突变型生物发光表型的M2幼苗繁殖到WRKY29表达改变的M3和突变体经flg22处理（awf突变体），然后在确认生物发光表型后选择。病因基因鉴定由MutMap。将awf突变体与亲本报告系（W29-1-4）杂交，自交F1后代获得F2。F2株用flg22处理并对其生物发光表型进行监测。对F2突变株的DNA进行全基因组测序通过MutMap分析来确定致病的单核苷酸多态性（snp）。

研究人员创建了9种转基因拟南芥报告系，该报告系中包含由防御基因启动子驱动的LUC基因。当植物受到PAMP（如flg22）处理时，启动子被激活，从而会产生生物发光。通过筛选24,000个经甲基磺酸乙酯 (EMS) 诱导的突变体，研究人员鉴定了22个在flg22处理后WRKY29表达改变的突变体（简称awf突变体）。与PAMP触发免疫相关的阿拉伯芥基因包括FLS2（鞭毛素感知受体），以及在研究中发现的其他三个未被之前关联的基因。通过结合Lumi-Map和MutMap，研究者能够快速识别出与PTI信号传导相关的致病突变。

图3：9个拟南芥报告系经flg22处理后的生物发光信号，转基因拟南芥植株8天大的幼苗包含pWRKY29-LUC、pWRKY18-LUC、pWRKY28-LUC、pRBOHD-LUC、pPAL1-LUC、pPR4-LUC、pERF1-LUC、pAt1g51890-LUC、pAt2g17740-LUC用水（绿色）或0.5µM flg22（蓝色）处理。实时监测每棵幼苗的生物发光情况系统在指定的时间点。数据以每次处理至少7株幼苗的平均值±标准误差表示。

本研究中利用拟南芥的种子构建转基因植株，

其后的Lumi-Map高通量筛选的流程如下：

1种子处理：表面消毒后的种子在4°C黑暗环境孵育2天解除休眠；

2播种：处理后的种子播至96孔微孔板，每孔加150 µl 半浓度液体MS培养基（含0.5%蔗糖和50 µM D-荧光素-K）；

3光照和处理：连续光照培养7天促发芽，发芽幼苗用 0.5 µM flg22、0.5 µM elf18或1 mg/ml几丁质处理；

4密封：用板封密封96孔板保持湿度防蒸发；

5生物发光测量：用生物化学发光微孔板读板仪进行批量检测；

6数据分析：用商业化软件 (SL00-01) 分析生物发光数据评估不同处理影响。通过这些步骤可有效测量幼苗在不同处理下的生物发光反应。

在上述案例中，Lumi-Map技术的创新之处在于将实时荧光素酶生物发光筛选与MutMap技术相结合，实现了对突变体的高效筛选和基因功能的快速鉴定。

实时监测：Lumi-Map技术可以实时监测荧光素酶的生物发光信号，从而快速筛选出具有特定表型的突变体。这大大缩短了研究周期，提高了研究效率。

高通量筛选：该技术可以同时对大量的突变体进行筛选，为大规模基因功能研究提供了有力支持。

基因定位：结合MutMap技术，可以快速确定与特定表型相关的基因位点，为进一步的基因功能研究提供了重要线索。

得益于Lumi-Map技术平台提供的高通量检测效率，该研究团队在后续进行了更多植物抗病的研究，并在Science杂质上发表了研究论文，首次在拟南芥中发现马铃薯晚疫病菌的鞘脂的受体，揭示了植物识别病原体特有脂质的机制。

此外，荧光素酶报告基因在转基因植物中还有很多其他应用：

1基因表达分析：通过监测荧光素酶的发光强度，可以实时、定量地分析目标基因在不同组织、发育阶段或环境条件下的表达情况。例如，在研究植物对逆境胁迫的响应时，可以利用荧光素酶报告基因观察相关基因的表达变化。

2启动子活性研究：将荧光素酶基因置于不同的启动子下游，构建成一系列报告基因载体，转化植物后可以分析启动子的活性。通过比较不同启动子驱动下荧光素酶的表达水平，可以确定启动子的强度、组织特异性和诱导性等特性。

3蛋白质定位研究：通过将荧光素酶与目标蛋白质融合表达，可以利用荧光素酶的发光信号来确定蛋白质在细胞内的定位。例如，研究人员可以将荧光素酶与细胞膜蛋白、细胞器蛋白或核蛋白等融合，观察其在植物细胞中的分布情况。

4信号转导研究：荧光素酶报告基因可以用于研究植物中的信号转导途径。例如，在研究植物激素信号通路时，可以将荧光素酶基因与激素响应元件连接，构建成报告基因载体。当植物受到激素刺激时，信号转导途径被激活，荧光素酶的表达也会随之改变。通过监测荧光素酶的发光强度，可以实时跟踪信号转导的过程，揭示信号转导的机制。

荧光素酶报告基因技术作为一种新型的转基因检测方法，与传统的转基因检测方法相比，荧光素酶报告基因技术具有明显的优势，

在转基因植物的研究中具有广泛的应用前景：

1操作简便性：传统的转基因检测方法，如 PCR、Southern blot、Northern blot 等，需要进行复杂的核酸提取、电泳、杂交等操作流程，既耗时又费力。而荧光素酶报告基因技术仅仅需要将报告基因载体转化到植物中，然后加入荧光素底物即可检测生物发光信号，操作简便快捷

2灵敏度：荧光素酶报告基因技术具有极高的灵敏度，能够检测到极低水平的基因表达。

3实时监测：荧光素酶报告基因技术可以对基因的表达变化进行实时监测，而传统方法只能检测某一特定时间点的基因表达情况。

4空间分辨率：通过将荧光素酶与目标蛋白质融合表达，可以利用荧光素酶的发光信号来确定蛋白质在细胞内的定位，具有较高的空间分辨率。而传统方法无法提供蛋白质的定位信息。

瑞孚迪可为荧光素酶报告基因提供高通量筛选系统：

EnVision多模式微孔板检测仪是一款具有多种发光检测体系的高通量微孔板检测仪，包括普通发光，增强发光，超敏发光等检测模式，其灵敏度高，串光率低，检测速度快，非常适合进行化学发光信号检测，可以兼容闪光模式和辉光模式，并可搭配注射器进行快速动力测试。

超灵敏化学发光模块，可使检测器更靠近样品，其灵敏度与标准化学发光相比提高了10倍左右，为您提供每个细胞的更多信息。

超灵敏化学发光模式使每块384孔板的检测时间从一小时以上缩短为不到两分钟，不仅节省了机器运行时间，还能大幅度降低漂移效应。

EnVision系统还包括了其他丰富的检测技术：

吸光度

荧光强度

荧光偏振

氙灯时间分辨荧光

激光时间分辨率荧光

Alpha，0.1nm光谱扫描等模式