Nature Plants：瑞孚迪AlphaScreen如何为植物“保鲜”，延长花期？

在园艺和植物科学领域，延长花卉的花期一直是研究的热点和挑战。近期，一项关于日本牵牛花花期延长的研究引起了广泛关注。研究团队使用AlphaScreen技术建立了一个高通量筛选系统，对一个包含9,600种化合物的文库进行了筛选，以寻找能够抑制EPH1-DNA相互作用的化合物，通过筛选成功地发现了两种抑制花瓣衰老的关键调节因子EPH1的DNA结合活性的化合物，从而显著延长了花卉的花期。

EPH1是一个NAM/ATAF1,2/CUC2（NAC）转录因子，是花瓣衰老过程中的关键调控因子，对花瓣衰老过程中的程序性细胞死亡（PCD）起着关键作用。

研究人员首先合成了带有C末端AGIA标签的EPH1蛋白，并确定了EPH1与其靶标DNA（VPE序列）的结合。通过AlphaScreen技术，他们检测到了EPH1与VPE DNA之间的强烈信号，而与突变的VPE DNA（mVPE）的结合则产生了很低的信号，表明该系统能够有效地检测EPH1与特定DNA序列的相互作用。

图1：EPH1与DNA相互作用的高通量分析系统的建立以及EPH1抑制剂的筛选流程。使用AlphaScreen技术，用于检测使用AGIA标记的EPH1蛋白与生物素标记的其靶标DNA之间的作用。

接着，研究人员利用这一系统对一个包含9,600种化合物的文库进行了筛选，以寻找能够抑制EPH1-DNA相互作用的化合物。他们发现了Everlastin1和Everlastin2，这些化合物能够抑制EPH1与DNA的结合，并显著延迟花瓣的衰老。通过进一步的分析，研究人员发现这些化合物通过抑制EPH1的二聚化来发挥作用，从而阻止了EPH1与DNA的结合。

图2：第一轮筛选中得到的化合物结果：G1、G2和G3类似物的抑制EPH1-DNA相互作用活性的测试结果，化合物对花瓣衰老的影响，以及它们对花瓣蛋白含量的影响。

图3：AlphaScreen技术检测Everlastin1和Everlastin2对EPH1与DNA相互作用及对EPH1蛋白二聚化的影响的影响：EPH1全长蛋白（EPH1-FL）与VPE DNA的相互作用的影响，EPH1 DNA结合域（EPH1-DBD）与VPE DNA的相互作用的影响。

通过RNA测序分析显示，这些化合物的处理强烈抑制了与程序性细胞死亡和自噬相关的基因表达。这些结果表明，针对转录因子的化学方法可以调节花瓣衰老，为延长观赏植物的花期提供了新的化学策略。

图4：Everlastin1和Everlastin2处理的花瓣的染色质免疫沉淀（ChIP）和转录组分析：使用抗EPH1抗体进行的ChIP-qPCR分析，以及Everlastin1处理对基因表达的影响。

研究人员通过体外实验和生物测定，进一步证实Everlastin1和Everlastin2处理能够延迟花瓣衰老的进程，验证了这些化合物在延迟花瓣衰老方面的效果，这一发现不仅为理解植物花瓣衰老的分子机制提供了新的见解，而且为开发延长观赏植物花期的化学制剂提供了可能。

图5：Everlastin1和Everlastin2对花瓣衰老的影响。图中展示了这些化合物对花瓣可见衰老的时间进程、蛋白含量、DNA降解以及花瓣面积的影响。

进一步分析与应用：研究还探讨了这些化合物可能对其他转录因子（如NAC TFs）的影响，并提出了进一步研究这些基因以增强对花瓣衰老分子机制的理解。此外，研究团队还考虑了这些化合物可能对其他转录因子和/或过程的影响及其在农业和园艺领域实际应用中的潜力，如通过喷洒或浸泡处理来延长盆栽或切花的花期。

在这项研究中，瑞孚迪（Revvity）公司的先进技术和仪器发挥了至关重要的作用。

瑞孚迪的高通量筛选系统

利用Envision多功能酶标仪搭配AlphaScreen技术检测。

Flexdrop纳升级分液器用于384孔AlphaPlate液体分配。

研究团队利用瑞孚迪的高通量筛选系统，对9,600种合成的化合物进行了筛选，寻找到了目标化合物。瑞孚迪高通量筛选系统的高效性和精确性为研究提供了强有力的支持，确保了筛选过程的准确性和可靠性。通过这一系统，研究团队成功地识别出了能够显著延迟花瓣衰老的化合物，为后续的实验奠定了基础。

关于Envision多功能酶标仪

更快的速度、通量和灵敏度

EnVision多模式微孔板检测仪具有更快的速度、更高通量和所有检测技术中的上佳灵敏度。作为高通量筛选的金标准，EnVision微孔板检测仪以更高灵敏度和通量，始终如一地为您提供强大的检测性能和稳定可靠的数据。

集多项成熟技术于一身

标准EnVision系统可检测所有传统检测技术：

吸光度

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化学发光，包括辉光型化学发光、闪光性化学发光和双报告基因化学发光

时间分辨荧光(TRF)和TR-FRET，包括我们的DELFIA、LANCE和LANCE Ultra技术，以及HTRF®和LanthaScreen™

荧光偏振

提高性能、容量和通量

我们的 AlphaScreen®和AlphaLISA®激光检测

技术，包括 AlphaPlex™

超灵敏化学发光

TRF激光检测模块

四光栅模块

关于AlphaScreen技术

在确认化合物活性时，AlphaScreen技术在这项研究中发挥了关键作用。这一技术能够精确检测化合物对EPH1与DNA相互作用的影响，确保筛选结果的准确性。AlphaScreen技术是一种基于微珠的非放射性检测方法，它具有多种优势，在蛋白质相互作用检测领域中比其他技术更为有效和方便：

高灵敏度：AlphaScreen技术利用供体和受体珠子之间的近距离相互作用产生信号，这种相互作用可以在非常低的浓度下检测到，因此具有很高的灵敏度。

高通量：可以在微孔板格式中进行，因此适合自动化和高通量筛选，这对于药物发现和化合物库筛选尤为便利高效。

宽动态范围：检测从皮摩尔到微摩尔范围内的蛋白质浓度，这使得它能够适应不同的实验条件和样品浓度。

高数据质量：利用时间分辨检测来区分特异性信号和背景信号，这有助于提高数据的准确性和可靠性。

适用性广泛：可检测多种类型的分子相互作用，包括蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-小分子等，样本包括细胞裂解物、血清、血浆、体液等生物学粗提取，而不会影响测读效果，这使得它在生物化学和分子生物学研究及药物研发领域中具有广泛的应用。

高度灵活性：可以与各种生物分子标签兼容，如生物素、链霉亲和素、抗体等，这增加了实验设计的灵活性。

关于FlexDrop纳升级分液系统

在文中提到的高通量筛选中，使用了瑞孚迪公司的FlexDrop仪器来分配试剂，将蛋白、抗体及微珠等精确地分配到384孔AlphaPlate中，以进行高通量筛选。

FlexDrop的使用大大提高了筛选过程的自动化程度，确保了试剂分配的精确性和重复性，这对于高通量筛选实验的成功至关重要。研究人员能够高效地测试大量候选化合物，以寻找潜在的EPH1-DNA相互作用抑制剂。

FlexDrop特点及应用：

96源孔+独立控制的8正压通道

精准分液，每个脉冲产生一个8-50 nL微滴

内置微滴检测系统，每个微滴计数和监测

死体积<1 uL，减少试剂浪费

FlexDrop在多领域的广泛应用：

基因组学及蛋白组学，药物筛选，试剂开发，NGS文库制备，PCR体系构建，化合物分配，细胞分液，高通量筛选，免疫分析，昂贵试剂的加液…