客户分享｜Caltech利用Beacon®多重检测和定量分析增强抗体发现应用

加州理工学院在2022年安装了布鲁克细胞分析的Beacon®单细胞光导系统，并成立了Beacon Center for Single Cell Biology中心，为研究院的科研工作者提供包括抗体发现在内技术服务。在今年布鲁克细胞分析的系列会议上，中心主任Kate Malecek博士分享了基于Beacon®开展的多重抗原结合筛选和亲和力评分用于抗体发现，这项技术为筛选病毒广谱中和抗体提供高效工具，同时也为评估比较不同的疫苗或免疫方法带来的差异化的抗体谱提供了高分辨率的表征手段。

单细胞光导系统多重抗原结合检测

Beacon®单细胞光导系统配备明场和五种滤光片，能够让研究者在单轮抗原-抗体结合筛选中通过使用IgG捕获微珠和不同荧光基团标记的抗原，筛选上万个单B细胞分泌抗体结合1～5种可溶性抗原（图1）。不仅如此，OptoSelect®芯片的流路设计和检测方法允许更换通道中的检测微珠，完成多轮抗原-抗体结合和功能筛选。在抗体分泌细胞几个小时持续分泌抗体的过程中，研究者能够在一天内完成多达十余种抗原的结合筛选，这是其他任何平台都难以做到的。

图1. 利用不同荧光基团标记抗原实现OptoSelect®芯片上多重检测

基于Beacon®的多重结合的结果具有重复性，而且能够被ELISA验证（图2）。最重要的是，Beacon®能够在最初的筛选阶段就找到能够结合多种抗原表位的抗体，这些关键信息能让研究者从众多候选分子中聚焦到所需特征的抗体序列，对最具潜力的分子进行下游验证，从而减少了后续重组表达和验证的工作量，提升抗体发现效率。

图2. Beacon®多重抗原结合和ELISA检测结果对比

多重抗原结合实验设计举例

多重筛选对于找到具有广谱能力的中和抗体来说非常重要，在Kate Malecek博士举例了一项针对九种来自不同冠状病毒的RBD区域筛选具有交叉反应和毒株特异性的小鼠抗体。每一轮检测中都使用FITC标记的IgG抗体检测单B细胞IgG抗体分泌情况。通过序贯完成四轮检测，研究者筛选到能够结合多种抗原的单B细胞，如图中Pen 1125和Pen 1284（图3）。这些细胞将被导出到96孔板上进行后续的VH/ VL测序。布鲁克细胞分析提供的软件上可以自动判读阳性孔，直观展示出每种抗原的筛选统计结果。

图3 多重检测鉴定具有高度交叉反应和毒株个异性的抗体

方法开发经验分享

Caltech在Beacon®上进行的多重检测在依照布鲁克细胞分析提供的实验指南给出的建议进行设计和优化，也分享了一些帮助提升多重检测质量和可重复性的可溶性抗原标记经验（图4）。为了保持检测的一致性和可比较的标记，建议在使用BirA共表达抗原时使用Avi标签和生物素化。利用亚化学计量标记来限制通过链霉亲和素四聚体的交联。虽然也可以使用随机生物素标记，但由于抗原有可能聚集，这会导致微珠和blooms看起来均一度欠佳。

图4. 多重分析中抗原标记最佳实践

此外，针对不同形式抗原的浓度，也需要进行针对性更改。如果是进行3～5种单体抗原的筛选，每种抗原的终浓度建议为0.5ug /mL （10-20 nM for 25-50kD蛋白）。如果是三聚体这样的复杂抗原，则建议将浓度减少到2-5 nM。对于检测中使用的二抗，不同的抗体会有差异，建议浓度在1:500～1:2500 范围内调整，这样能够获得更加的检测结果。

多重检测和亲和力评分用于评估抗体谱

Beacon®的多重检测和亲和力评分能够帮助多个研究方向的科研工作者解决关键问题，除了能够在不同的物种，包括免疫后的小鼠、兔和感染恢复期/疫苗接种后的患者体内，筛选具有特定多重病原表位结合能力的抗体，用于治疗性抗体或者检测抗体的开发。这种快速、便捷、高通量的分析方式还为深入理解在疫苗接种后或者感染后的抗体反应谱提供了探索方式（图5）。相比于传统基于血浆的批量检测方法，Beacon®提供单个抗体特性的分辨率，对于理解抗体的多样性和功能特性提供更加具有启发性的结果。利用这项信息，研究者可以获得更加全面的抗体谱的评估，进而深入理解不同的疫苗或者免疫策略对诱导出的差异化抗体。

图5. 利用多重筛选和亲和力评分比较不同个体的抗体谱

相关阅读

重磅推出 | Beacon亲和力评分上市，抗体选择不再“随机”

目前，Caltech的Beacon®中心已经为众多研究者提供抗体发现和其他研究领域的技术服务，在前两年中就开展了多达25项新型抗体序列的开发和专利申报。

Beacon®单细胞光导系统作为开放型的单细胞功能研究工作站，通过利用它能够分离、培养、分析和导出单细胞的技术特性，还能够被应用于包括T细胞的功能表征、贴壁细胞克隆、CRISPR筛选等多重不同的应用领域中（图6）。

图6. Beacon®单细胞光导系统的更多应用