三篇Nature子刊 | 看顶级细胞治疗研究在用的单细胞分泌蛋白组评估

布鲁克的IsoSpark/IsoLight单细胞功能蛋白质组学分析平台近些年被广泛应用于细胞疗法的临床前和临床试验当中，对回输前或回输后的免疫细胞的分泌蛋白组进行评估。并且已经有多篇研究表明免疫细胞的多功能性（分泌两种或两种以上细胞因子细胞占比）和PSI（多功能强度指数，多功能细胞和其分泌的细胞因子强度）与患者的预后具有相关性。今天与大家分享近期发表在Nature子刊上面的三篇文章，覆盖的研究方向包括CAR-T和 CAR-NKT细胞的临床前细胞效能的影响因素，以及一项临床I/II期的通用型CAR-NK细胞产品的成果。

01

CAR亲和力调节CAR-T细胞

对PD-1/PD-L1介导抑制的敏感性

发表期刊

Nature Communications

文章题目

CAR affinity modulates the sensitivity of CAR-T cells to PD-1/PD-L1-mediated inhibition

通讯作者单位

西班牙IDIBAPS研究所

研究主要内容

针对实体瘤的CAR-T细胞疗法面临着重重阻碍，其中包括由PD-1/PD-L1轴介导的T细胞抑制。研究者已经在探索不同破坏PD-1/PD-L1轴对T细胞的影响。在这项工作中，研究者假设CAR-抗原亲和力可能是调节T细胞对PD-1/PD-L1轴敏感性的关键因素。他们在各种临床前模型中系统地研究了以低亲和力（LA）或高亲和力（HA）靶向HER2的CAR-T细胞。通过使用肿瘤细胞系的体外模型和经过修改以显示不同PD-L1密度的支持脂质双层，研究人员发现LA CAR-T细胞对PD-L1介导的抑制的敏感性比HA细胞增加。PD-1敲除可增强LA CAR-T细胞的细胞因子分泌和体外多功能性以及体内抗肿瘤作用，并导致与T细胞衰竭相关的基因特征下调。相比之下，HA CAR-T细胞特征在PD-1敲除后不受影响。这项研究结果可能为涉及破坏PD-1/PD-L1通路的CAR-T疗法提供信息，帮助更加有效地治疗实体瘤。

单细胞分泌蛋白组分析证明PD-1敲除可增强低亲和力而非高亲和力CAR-T细胞的多功能性

研究者在bulk RNA测序分析中发现涉及编码细胞因子的基因的转录本变化，并且由于CAR-T细胞的多功能性之前已证明与临床结果的改善相关，因此他们了评估PD-1敲除是否会增加HER2-28Z CAR-T细胞在抗原暴露后的多功能性。研究者使用布鲁克的IsoCode适应性免疫细胞因子芯片对抗原暴露后的低亲和力（LA）和高亲和力（HA）HER2-28Z CAR-T细胞进行了单细胞分泌组分析。

在3D t-SNE分析中观察到Mock组和PD-1敲除的LA CAR-T细胞分离成不同的簇，揭示了两组之间的关键功能差异（图1a）。相比之下，PD-1的敲除对于HA CAR-T的影响并不明显（图1b）。这些结果与之前的基因表达分析一致。更深入的分析中，LA HER2-28Z CAR-T细胞中PD-1敲除显示出在CD4+和CD8+ T细胞群中多功能细胞（能够分泌两种或两种以上细胞因子）增加的趋势（图1c），且由于LA HER2 CAR-T细胞中的PD-1破坏，其总体的PSI（多功能强度指数）增加，在分析的32种细胞因子中效应细胞因子占主导地位（图1e）。相反，在HA HER2-28Z CAR-T细胞中敲除PD-1并没有显著增加T细胞的多功能性或PSI，这意味着PD-1破坏的影响较小（图1d、f）。单细胞分泌组分析还表明，LA PD-1 KO CAR-T细胞中IL-13、IL-22或IL-4等调节性细胞因子的表达降低，而PD- L1敲除并没有改变HA CAR-T细胞中这些细胞因子的表达（补充图）。以上结果表明，与T细胞活化相关的基因上调以及增强的多功能性可能有助于提高 LA HER2-28Z PD-1 KO的抗肿瘤功效。

图1. PD-1 KO LA 和 HA HER2-28Z CAR-T细胞的多功能性分析。

02

IL-12将表达CAR的自然杀伤T细胞重编程

为具有强效抗肿瘤活性的长寿Th1极化细胞

发表期刊

Nature Communications

文章题目

IL-12 reprograms CAR-expressing natural killer T cells to long-lived Th1-polarized cells with potent antitumor activity

通讯作者单位

美国北卡罗来纳大学Lineberger综合癌症中心

研究主要内容

人类自然杀伤T细胞（NKT）被越来越多地用于癌症免疫治疗。这项研究发现，表达促炎细胞因子白细胞介素-12（IL-12）能够使人NKT经历广泛且持续的分子和功能重编程。具体来说，IL-12在体内指导并维持NKT中的Th1极化程序，而不会导致其功能衰竭。此外，IL-12在体内能够维持长期表达CD62L的记忆NKT。值得注意的是，IL-12启动CD62L阴性NKT中记忆NKT的从头编程，表明外周血中循环的NKT具有内在的分化层次，并且IL-12能够促进NKT分化为长寿命的Th1极化记忆细胞。经设计以共表达嵌合抗原受体（CAR）并结合IL-12表达的人类NKT在白血病和神经母细胞瘤肿瘤模型中抗肿瘤活性增强，在体内能长期持续并保留由IL-12表达驱动的分子特征。IL-12揭示出人外周NKT的内在可塑性，这可能在细胞疗法的发展中发挥关键作用。

单细胞分泌蛋白组分析表达

IL-12的NKT细胞的功能变化

研究者首先构建了表达IL-12的NKT细胞。他们从外周血中分离、扩增和转导人类NKT。将GFP与IL-12的两个亚基进行融合表达。NKT的转导效率和纯度分别高于70%和90%。IL-12可在L12(I)GFP NKT上清液中检测到。与对照GFP NKT相比，IL12(I)GFP NKT表现出更高的IFN-γ释放和降低的IL-4释放。相应的qPCR分析也检测到L12(I)GFP NKT中 IFN-γ和T-bet的mRNA升高。

研究者进一步评估了IL-12表达是否促进多功能NKT的产生。NKT用逆转录病毒载体转导，其中GFP被ΔNGFR交换以允许对转导的NKT进行分选和处理，以在单细胞分辨率下评估多功能性。表达IL12的活化NKT显示出明显更高的多功能性（分泌两种或更多种细胞因子的细胞百分比）（图2j和图3D）。此外，与对照NKT相比，表达IL-12的NKT显示出更高的多功能强度指数（PSI，多功能性与细胞因子分泌强度的组合)，并且显示出明显更高的效应子和炎症PSI (图3E)。总体而言，这些数据表明表达IL-12的NKT是多功能Th1极化细胞，并且IL-12具有自分泌/旁分泌作用模式。

图2. 表达IL-12对NKT功能的影响。

图3.表达IL-12对NKT多功能性和PSI的影响

03

同种异体CD19特异性CAR-NK细胞

在CD19+ B细胞肿瘤中的安全性、有效性

及响应决定因素的一项临床1/2期试验

发表期刊

Nature Medicine

文章题目

Safety, efficacy and determinants of response of allogeneic CD19-specific CAR-NK cells in CD19+ B cell tumors: a phase 1/2 trial

通讯作者单位

美国MD安德森癌症中心干细胞移植和细胞治疗系

研究主要内容

该研究是针对37名复发或难治性CD19阳性B细胞恶性肿瘤患者开展一项I/II期试验，试验对象是同种异体脐带血来源的表达抗CD19嵌合抗原受体和白细胞介素15的自然杀伤细胞（CAR19/IL-15 NK）。结果显示，患者没有出现严重细胞因子释放综合征、神经毒性或移植物抗宿主病。第30天和第100天的OR率均为48.6%。一年总生存率和无进展生存率分别为68%和32%，获得OR的患者有更高水平的CAR-NK细胞数量和更长的持久性。还发现脐带血单位（CBU）接收时有核红细胞≤8×107且采集到冻存时间≤24小时是CAR-NK获得优异结果的最重要预测因素。来自最佳CBU的NK细胞具有高度功能性且高表达效应相关基因。而来自次优CBU的NK细胞会上调炎症、缺氧和细胞应激程序。这些发现揭示了CAR-NK细胞生物学的新特点，并强调了供体选择对于同种异体细胞疗法的重要性。

单细胞分泌蛋白组分析Opt-Cs和Sub-Cs

中NK细胞的功能

为了确定基于脐带血单位质量的治疗效果差异的潜在机制，分别比较了从最佳（Opt-Cs）和次优（Sub-Cs）CBU得到的CAR-NK细胞。研究者首先比较了输注产品中CAR的表达、体外增殖和表型，这些参数在Opt-Cs和Sub-Cs的NK细胞之间没有显著差异。体外长期肿瘤再攻击试验表明，虽然Opt-Cs和Sub-Cs中的CAR19/IL-15 NK细胞在单次肿瘤攻击后消除CD19阳性Raji细胞的效果相同，但Sub-Cs中的CAR19/IL-15 NK细胞在再攻击后失去了控制肿瘤生长的能力。多功能性和代谢适应性是有效抗肿瘤NK细胞反应的重要决定因素。IsoCode单细胞分泌蛋白组芯片检测结果表明，与Sub-Cs相比，来自Opt-Cs的CAR19/IL-15 NK细胞对CD19抗原刺激的多功能强度指数（PSI）明显更高（图4b）。线粒体代谢和糖酵解活性分析显示，来自Opt-Cs的CAR19/IL-15 NK细胞的氧化磷酸化更高(图4c )，而其糖酵解能力没有差异 (图4d )，这表明线粒体适应性更高。为了验证在临床CAR19/IL-15 NK细胞产品中观察到的结果，研究者从脐带库中选择了12个额外的CBU来生成CAR-NK 细胞。研究者还证实了Opt-C对CAR-NK细胞和NT-NK细胞均具有优异的PSI和线粒体适应性。

图4.临床CAR19/IL-15 CBU-NK细胞在Opt-Cs和Sub-Cs中的功能差异