瑞孚迪（Revvity）均相检测技术助力癌症免疫治疗的双特异性抗体研究

在癌症免疫治疗时代，诸如PD-1单抗等的热门单靶点药物竞争已呈现白热化状态，产品同质化严重，市场空间被严重挤压，且存在耐药性风险，以上问题刺激了对具有增强特异性和效力的双特异性抗体的研究。双特异性抗体（bsAb）是免疫疗法中快速发展的领域，作为下一代癌症治疗策略备受关注。BsAb是重组分子，旨在同时靶向两种不同的抗原或表位。这些抗体具有双重链和轻链组成的传统 Y 形结构，每个臂都有一个独特的活性位点，可与不同的靶标结合。根据生物学靶点和作用方式，bsAb分为四大类（如Figure 1）：

Figure 1. The types of bispecific therapeutics in immuno-oncology.

BsAb独特的作用机制在各种癌症的临床前和临床研究中取得了良好的疗效，目前，已有八款癌症免疫治疗bsAbs获得FDA/EMA 的批准（如Table 1）。

Table 1: Approved therapeutic bsAbs for cancer indications.

相比于传统单抗，bsAb在治疗方面更具潜在优势，包括：（1）介导免疫细胞对肿瘤的杀伤；（2）增强对免疫系统的激活作用；（3）双靶点信号阻断，防止耐药；（4）具备更强特异性、靶向性和低脱靶毒性；（5）介导更强的内吞作用。

BsAb 的功效、安全性和临床成功受其特性的影响，包括理化特性（大小、稳定性、结合亲和力和效价）、药代动力学 (PK)/药效学 (PD) 特性、可制造性和免疫原性等，bsAb的全面表征对于其设计和开发以及评估其功效和安全性至关重要，故需要从多方面并结合一系列技术来全面了解bsAb的特性以及驱动免疫系统靶向癌细胞的能力。在这里，我们介绍几种均相检测技术来表征靶向免疫检查点和肿瘤坏死因子 (TNF) 超家族的新型bsAb。

BsAb表征过程中的细胞因子研究的重要性

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（1）Evaluation of an anti-PD-1–GITR-L bispecific antibody

Chan等人研究了由抗PD-1抗体与抗GITR-L抗体融合组成的bsAb对免疫细胞活性的影响。作为研究的一部分，研究者进行了PBMC共刺激检测，以探究bsAb治疗对细胞因子释放的影响——将PBMC铺板并在抗CD3存在的情况下用不同稀释度的抗体进行处理。孵育48h和96h后，使用AlphaLISA®试剂盒检测收集的上清液中的IFN-γ和IL-2水平，并使用具有Alpha模块的酶标仪对结果进行定量。

结果显示，与单一治疗和1:1联合治疗相比，bsAb（抗 PD-1–GITR-L）治疗可诱导细胞因子的剂量依赖性增加（如Figure 2）。该数据不仅提供了关于bsAb如何影响免疫细胞行为的见解，还强调了与单一疗法和联合疗法的效果相比，抗PD-1-GITR-L双特异性抗体如何具有不同的作用机制。

Figure 2: Human PBMC co-stimulation assay following the indicated treatments in the presence of anti-CD3. Cells and supernatants were harvested/collected for assessment of (A) IL-2, (B) IFN-γ, and (C) IFN-γ secretion in autologous CD4+ T cell MLR.

Figure 3: Principle of the AlphaLISA technology

AlphaLISA是一种基于微珠的均相检测技术，AlphaLISA细胞因子测定使用两种针对目标细胞因子的特异性抗体。一种是生物素化的，与链霉亲和素包被的供体微珠结合，另一种则直接与受体微珠结合。在细胞因子存在的情况下，抗体与细胞因子结合，使供体和受体微珠靠近，当供体微珠激发后产生单线态氧进而激发受体微珠产生特异性信号，生成的AlphaLISA信号与样品中存在的细胞因子的量成正比关系。

（2）Evaluation of an anti-PD-L1–VEGF bispecific antibody

2021年上海复旦大学张雪梅团队开发了一种新型双特异性抗体HB0025，该抗体同时靶向PD-L1和VEGF。该bsAb是通过将VEGF受体1结构域(VEGFR1D2)与抗PD-L1 mAb融合而形成的。作为研究的一部分，研究人员通过测量细胞因子分泌水平来评估HB0025阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的能力。将PBMC与树突状细胞在96孔板中共培养，并接受HB0025、atezolizumab（一种PD-L1靶向抗体）、bevacizumab（一种VEGF靶向抗体）、阴性对照 (900543) 的处理。经过5天的孵育期后，使用HTRF技术检测上清液中IL-2的浓度。

结果显示，HB0025和atezolizumab均以剂量依赖性方式促进IL-2分泌增加，VEGF靶向抗体bevacizumab不会影响IL-2的分泌（如Figure 4）。该数据证明了HB0025的抗肿瘤作用，并表明新型双特异性抗体有效维持了其parent molecular的结合和阻断能力。

Figure 4: The dose-effect fitting curve of antibodies on the recovery of human IL-2 secretion, taking 900543 as the negative control.

Figure 5: Principle of the HTRF assay

HTRF是一种基于荧光基团的均相检测技术，该技术将荧光共振能量转移 (FRET) 技术与荧光时间分辨测量相结合（如Figure 5）。针对细胞因子检测，其中一个抗体标记了供体荧光基团，另一个抗体标记了受体荧光基团，当加入待分析物时，如果待分析物同时与两个抗体都结合，则供体荧光基团和受体荧光基团的距离被拉进，当激发供体荧光基团后，供体和受体之间产生FRET，进而激发受体荧光基团产生特异性信号，该信号与待分析物的浓度成正比关系。

BsAb表征过程中的杀伤作用的重要性

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Rajendran等人研究靶向CD30和CD137的bsAb是否可以增强基于抗体治疗霍奇金淋巴瘤（HRS）的特异性。该BsAb设计用于选择性结合CD30/CD137双阳性HRS细胞。为了测试bsAb的杀伤效率，研究者使用DELFIA® EuTDA试剂盒进行了ADCC测定。该项研究中，HRS细胞用DELFIA BATDA试剂标记，并与双特异性抗体和对照抗体一起接种到96孔板中，然后添加效应细胞（NK细胞）并孵育3h。该测定的读数基于使用多功能酶标仪测量的荧光值，测量的信号值与裂解细胞的数量直接相关。

结果表明，与对照抗体相比，使用两个bsAb clone进行处理可使双阳性 (CD30+ CD137+) 细胞的杀伤率增加约4倍（如Figure 6）。此外，与自发裂解水平相比，这些clone对单阳性细胞的杀伤效率相当。这表明bsAb对双阳性细胞的选择特异性，突出了bsAb触发针对特定细胞群的ADCC潜力。

Figure 6: ADCC activity of bispecific antibodies.

HL cells were labeled with 1 μl/ml of BATDA reagent and treated with 5μg/ml of bispecific antibodies (137A-30A, 137A-30B) or human IgG(Isotype) for 40min at 4°C. Effector NK cells were added at E:T of 20:1 and incubated for more than 3 hours. Means ± SD of fold killing are represented (**p<0.01). Data are representative of three independent experiments.

Figure 7: DELFIA EuTDA Cytotoxicity Assay for ADCC Determination.

DELFIA Eu TDA检测法是一种非放射性的细胞杀伤检测方法，具有标记特异性，高灵敏度，可操作性，安全性，稳定性等优点。如Figure 7，靶细胞与BATDA进行孵育标记，然后与抗体结合，并与免疫效应细胞共培养。抗体与靶细胞表面的抗原结合，而效应细胞与抗体的Fc区结合，与靶细胞形成复合物。复合物的形成会激活免疫效应细胞，从而对靶细胞进行细胞裂解，细胞裂解后TDA被释放到上清液中。将上清液转移至新的检测板中，并添加Eu3+ solution以形成EuTDA螯合物，使用兼容时间分辨荧光（TRF）的酶标仪进行读值（设置检测信号在340nm处激发，在615nm处发射）。

小结

双特异性抗体的成功在于其能够克服当前免疫疗法的局限性，并提高疗效和安全性。尽管目前获批的bsAb产品不多，但随着血友病领域首个双特异性抗体 Emicizumab的成功上市，并在5年间成为年销售额33亿美元的全球重磅药物，引发了一波双特异性抗体研发热潮。

瑞孚迪（Revvity）拥有一系列的高通量检测技术平台（HTRF，ALPHA，LANCE，DELFIA），同时还提供Toolbox 试剂以及实验服务，可以满足您对双特异性抗体研究的多种需求，助力您获得卓越的结果。