实现免疫细胞高效基因转导的三个步骤

图1：免疫系统细胞分化图

一种将底物递送到人体免疫细胞的便捷技术是Nucleofector^TM技术，这是一种改进的电穿孔技术。专用的Nucleofector^TM解决方案与针对特定细胞类型优化的电转参数相结合，使研究人员能够实现高转染效率和良好的存活率。底物直接输送到细胞质和细胞核。小化的免疫原性保留了免疫细胞的功能(图2)。

Nucleofector^TM技术不仅保证了效率和可行性。考虑到表达CAR的T细胞^[4]和NK细胞^[5]以及基因组编辑^[6]，不同底物的共转染也是可以简单的实现-在大小和底物类型上具有很大的灵活性，如DNA、RNA和蛋白质。

通过使用4D-Nucleofector^TM技术，实现封闭和可扩展的转染应用。它可以很容易地从用于基础研究或筛选目的的20-100ul小规模体系到高达20ml的后续应用，例如用于细胞治疗的体外修饰。

不管底物递送的方法是什么，免疫细胞在转染前的状态决定了之后细胞的活性和功能。细胞对转染过程的反应有多强烈或敏感，一方面取决于分离过程，另一方面也存在供体特性的问题。

能够获得血液或骨髓样本以自我分离免疫细胞的研究人员，应确保遵守既定的分离、刺激免疫细胞的标准操作程序。严格按照说明操作将产生可比较和可重现的结果。

如果无法获得这种来源，研究人员就会利用商业上可获得的造血细胞和免疫细胞进行研究。这有利于在质量控制和优化培养系统方面的工作。

然而，无论细胞的来源是什么，原代细胞都是来自单个有机体的细胞。捐赠者特定的差异是不可避免的，并将导致结果差异^[7]。

对于病毒转导来说，病毒颗粒的制备是复杂的，而用于改良电穿孔的底物选择则更加多样化。

为了确保佳的条件，底物应该是高质量的。当我们选择质粒DNA进行基因递送时，有许多需要考虑的方面，关于载体DNA的信息可以在Lonza Important Vector Factors for Gene Expression Technical Reference Guide中找到。

底物的大小和浓度是这个游戏中的额外玩家。底物大小本身通常不是影响转染效率的主要因素，但当质粒大小超过约15kb时，效率会有所下降。因此，在转染较大的质粒时更要考虑实验所需的DNA量和质粒的完整性。增加每个反应的DNA含量通常会提高转染效率，但由于高浓度的DNA可能会对细胞产生毒性，细胞存活率可能会降低。对于Nucleofection实验，推荐的底物浓度通常在2-5ug/100ul(DNA)、2 nM-2uM(siRNA)和10-20ug/100ul(mRNA)之间。

表2：人类原代免疫细胞Nucleofection条件、结果和参考文献(OP：optimized protocol可用的优化方案，IHD：in-house data基于内部数据)

Lonza.com/new-4D-Nucleofector

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Selected References:

1 ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering

2 Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques

3 Nucleofection – Combining High Transfection Performance with Superior Preservation of Functionality

4 A new approach to gene therapy using Sleeping Beauty to genetically modify clinical-grade T cells to target CD19

5 Genetic manipulation of NK cells for cancer immunotherapy: Techniques and clinical implications

6 A genome-wide CRISPR screen identifies a restricted set of HIV host dependency factors

7 Human immune system variation

8 Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells

9 Alterations in Cholesterol Metabolism Restrict HIV-1 Trans Infection in Nonprogressors

10 Altered expression of miR-181a and miR-146a does not change the expression of surface NCRs in human NK cells

11 Hyperactive piggyBac Gene Transfer in Human Cells and In Vivo

12 Characterization of Programmed Death-1 Homologue-1 (PD-1H) Expression and Function in normal and HIV Infected Individuals

13 IL-27 inhibits HIV-1 infection in human macrophages by down-regulating host factor SPTBN1 during monocyte to macrophage differentiation

14 Generation of multivirus-specific T cells to prevent/treat viral infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant