为什么重组C因子可以代替鲎试剂用于内毒素检测？

随着技术的进步，内毒素检测方法也从初的兔热原检测法（RPT）发展到鲎试剂检测法(LAL/TAL)，再到如今的重组因子C(rFc)法，经历了从体内到体外，从少量到通量，从缓慢到快速的逐步发展更替，来不断满足行业发展的需求。

近年来，重组C因子内毒素检测法以其快速、简单、非动物源等特点受到越来越多的关注，有望替代鲎试剂，成为内毒素检测的主要方法。我们将从4个方面论述了这一替代趋势的必然性：

• 从原理角度看，LAL和rFC都能用于内毒素检测
• 重组生物技术的发展必然带来检测方法的革新
• 对rFc检测法在应用中所面临的阻力的深度理解
• 对rFC法接受度的逐步增长及法规和监管状态加持

1）LAL既定效用；2）重组技术的发展；3）对面临阻力的深度理解；4）接受度的逐步增长

从工作原理上看，LAL和rFC都能用于内毒素检测

从原理上看，rFC方法的发明是基于对鲎试剂法内毒素检测的级联反应的通路理解。生物化学家表征了鲎凝血级联中的蛋白质成分，系其血细胞和变形细胞中的一系列丝氨酸蛋白酶（C因子、B因子、G因子和凝固酶原、凝固蛋白原）[1-2]，这些丝氨酸蛋白酶负责在内毒素存在时的鲎血液凝固（图3），为行业内从凝胶法检测发展到动态浊度法、动态显色法，之后发展到rFC方法提供了科学依据。同时，标准品CSE/RSE和国际标准的建立也为包括rFC方法的定量检测打好了良好基础。

重组生物技术的发展必然带来检测方法的革新

自1982年，礼来公司生产出了个商业化重组人胰岛素Humulin®以来，越来越多的治疗性大分子被开发，也给生物技术行业带来了一股新的力量。多年来，科学家一直在试图生产出一种可持续、环保、经济的人工合成内毒素识别因子,保护鲎资源。

随着对凝血级联酶的认知不断积累，科学家们对内毒素其敏感的丝氨酸蛋白酶因子C进行了基因工程改造。从开始了解C因子的生化性质，到使用分子生物学技术进行克隆，并在各种宿主（细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞）中表达全功能重组因子C蛋白，历经了15年[3-5]，终确定重组C因子(rFC)的多功能结构域，使其成为一种具有酶活性的前体，识别和结合内毒素后表现出催化活性。

rFc法只需一步即可酶切荧光底物产生荧光，并根据底物酶切的量来反馈内毒素含量，完全符合实验动物的3R原则：减少，替换，优化，以及第四个“R”原则，即内毒素检测的重现性。因此，采用rFC代替LAL的优势是显而易见的。

对rFC检测法在应用中所面临阻力的深度理解

在生物医药领域，药品和诊断产品受到高度监管，采用可靠的LAL内毒素检测替代方法，例如rFc方法，对水、原材料和过程样品的测试都非常重要，因为替代方法的使用可以大约节约90%的鲎试剂使用。近半个世纪以来，尽管LAL检测也存在一些问题，制药公司和医疗保健行业仍在很大程度上依赖于LAL，直到2004年，rFC方法才商业化。

但是，从RPT到LAL，从LAL到rFC，内毒素检测方法的更替都是基于行业发展的需求，纵观历史，都需要一定的时间，需要行业的反复论证和实践检验。

迄今为止，rFC检测方法认可度也算是在逐渐提高，也是一种久经考验的LAL检测补充或替代方法。不仅仅具有“3S”优势Scientific characterization（可靠）、Sensitivity（灵敏）和Specificity（特异），还具有易于被大规模、批量、自动化生产，批间一致性有保障，不受G因子旁路干扰等特点，更有利于制药公司获得准确、可靠检测结果。

rFC的未来之路——法规和监管状态（美国、欧盟、中国）

多年来，科学家们一直设想将鲎的先天免疫研究结果应用于生物技术、制药和人类保健行业。C因子和许多其他进化保守的分子已被确定为在免疫防御、抗菌作用和治疗败血症方面具有实用性，LAL也应该重点用于拯救生命和提高生活质量的分子研究[6-7]。基于rFC的内毒素检测的应用已在全球范围内得到研究应用的支持，缓解了洁净技术中对鲎的需求。礼来公司采用rFC 进行药物质量控制，其中四个已成功获得FDA的认可，证明了rFC用于注射药物安全性检测的可靠性和价值[8-9]。

从资源可及性角度看，鲎的持续捕捞也非常不明智，它会给整个医药产品供应链带来风险。很多科学家也在努力促进使用合成rFC代替LAL，以保护鲎免于灭，加速了rFC作为药典试验的采用。随着制药行业发展，越来越多法规许可rFC作为LAL方法的替代方法（表1）。目前有超过100家新冠疫苗生产公司在使用rFC方法用于质控，以实现高效的过程生产和质量保证。

Lonza是家被授权生产rFC因子的厂商，其中PyroGene重组因子试剂盒已被多家药企使用。一项全球、多中心研究显示，使用PyroGene从水和其它测试产品中回收内毒素与基于LAL的方法相当。试剂盒验证的结果发表在药典论坛36[1]卷（2010年1月-2月）。

自1970年至今半个世纪以来，Lonza作为较早期开发内毒素检测产品的公司，为全球客户提供包括细菌内毒素检测试剂盒、内毒素检测软件、内毒素检测酶标仪在内的一站式解决方案，符合FDA21CFR part 11和欧盟EUGMP附录11法规要求，已用于国外大量药物的放行上市，满足出口型/双报制药企业的规模化内毒素测定需求。

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