GPCR药物研发的“好东西”，让您更快、更精准地实现多种信号通路检测

GPCR (G Protein-Coupled Receptor)，即G蛋白偶联受体，在人体内分布广泛，参与众多生理过程，其功能异常与肿瘤、心脏病、糖尿病、阿尔茨海默症等重大疾病密切相关。GPCR 可以通过激活G蛋白（包括 Gαs、Gαi、Gαq 等不同亚型）和β-arrestin蛋白来启动下游信号通路。目前已上市的GPCR药物基本都是靶向GPCR结构中的正构位点（orthosteric sites），由于GPCR正构位点包含高度保守的残基，相同的正构药物分子可以激活同类型受体，通常会同时激活或抑制多种信号通路，难以实现精细调控。目前，GPCR偏向性别构调控药物的研发比例在逐步提高，偏向性别构调控药物结合在 GPCR 的别构位点上，能够选择性地调节GPCR信号通路。

由此可见，由于GPCR的复杂性和多样性，在进行GPCR药物高通量筛选时，需要对候选药物进行大量的验证和优化，以确保其对于下游信号通路的精细调控。

瑞孚迪 (Revvity) 基于HTRF和Alpha的均相免洗技术平台，提供G蛋白信号通路（如cAMP、IP-1等）和 β - arrestin 蛋白信号通路相关HTRF& Alpha检测试剂，让您快速、准确地进行GPCR药物的高通量筛选。

G蛋白信号通路

GTP Binding HTRF assay

G蛋白是三聚体GTP -结合调节蛋白的简称，由 α、β、γ 三个亚基组成。在未激活状态下，α 亚基结合 GDP，整个 G 蛋白处于非活性状态。当 GPCR 被激活后，它可以促使 G 蛋白的 α 亚基与 GDP 解离，并与GTP结合，从而激活下游信号通路。

瑞孚迪运用HTRF原理，对不可水解的GTP类似物进行Eu Cryptate标记，同时对抗Gαi的单克隆抗体标记D2。当Gαi和GTP结合，便会产生FRET信号。这个特定的信号与Gαi激活态成正比，原理如图1所示。

图1. GTP Binding assay Kit原理

第二信使检测

当GPCR被激活后，GTP结合的Gα亚基可以调节腺苷酸环化酶（AC）的活性激活下游信号，Gαs 和Gαi亚型分别激活或抑制腺苷酸环化酶，将ATP转换成 cAMP；Gαq或Gαo等亚型激活磷酸肌醇磷脂酶 C 酶，将磷脂酰肌醇 4,5 - 双磷酸酯水解为 DAG 和 IP3，IP3的半衰期很短，其产生后在磷酸酶的作用下生成IP2，然后生成IP1。

瑞孚迪cAMP和IP-1检测试剂盒均基于竞争法，以HTRF cAMP试剂盒为例，该试剂盒提供Eu标记的特异性抗体以及与D2偶联的cAMP。能够直接对作用于贴壁细胞或悬浮细胞中与Gs/Gi蛋白偶联受体的所有类型化合物进行鉴定。细胞产生的cAMP会与D2标记的cAMP竞争，以结合Eu标记的特异性抗体，样本中cAMP的含量与HTRF成反比，原理如图2所示。

图2. cAMP assay Kit原理

β-arrestin信号通路

β-arrestin主要包括β-arrestin1和β-arrestin2，它在G蛋白偶联受体（GPCR）信号通路的调节中发挥关键作用。当配体与 GPCR 结合并激活 GPCR 后，GPCR会发生构象变化。随后，G 蛋白偶联受体激酶（GRK）会磷酸化激活后的 GPCR 的胞内段，磷酸化后的GPCR为β-arrestin提供了结合位点，从而招募β-arrestin与之结合。β-arrestin与GPCR结合后，会进一步发生构象变化。这种变化使得β-arrestin能够与其他信号分子相互作用，开启自身的信号通路。

β-Arrestin招募实验通过激活GPCR检测内源性β-arrestin 2和AP2的招募来判断配体对β-arrestin信号通路的影响。瑞孚迪运用HTRF原理，对抗AP2抗体和抗β-Arrestin抗体分别标记Eu和D2，当AP2和β-Arrestin被招募到受体时，便会产生FRET信号，原理如图3所示。

图3. β-arrestin 2 recruitment Kit原理

磷酸化途径

在GPCR药物研发过程中，外源性激动剂会导致GPCR构象变化，随之胞内GRK识别激活受体，细胞内丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化。此外，第二信使调节的激酶也可以参与GPCR磷酸化，包括激酶A和C以及其他丝氨酸/苏氨酸激酶。磷酸化还会增加GPCR与β-arrestin的相互作用，从而触发第二波信号传导。

以瑞孚迪磷酸化ERK（Thr202/Tyr204）为例。该试剂盒使用2种标记抗体：一种是带有供体荧光团与蛋白质上的磷酸化序列特异性结合的抗体，另一种是带有受体荧光基团识别蛋白质的抗体。当样本中含有磷酸化蛋白时，会拉近供体荧光基团和受体荧光基团的距离，从而产生FRET信号。其强度与样品中存在的磷酸化蛋白质的浓度成正比，原理如图4所示。

图4.磷酸化蛋白检测kit原理图

部分磷酸化蛋白检测试剂盒列表

GPCR结合实验

在药物研发的早期阶段，通过结合实验，可以证实药物是否能够特异性地与目标GPCR结合。结合实验还可以通过比较不同药物与GPCR的结合亲和力，筛选出最有潜力的候选药物进行进一步的研发。

瑞孚迪采用Tag-lite 技术是将SNAP-Tag与HTRF技术相结合，用来进行活细胞表面受体分析，用于研究GPCR和配体的相互作用，原理如图5所示。

图5.Tag-lite技术原理图

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