实验秘籍 | 瑞孚迪「HTRF技术」：给你的实验叠个BUFF！

实验通关秘籍之

HTRF技术篇

给你的实验叠个buff~

说起实验室常用的免疫检测方法，

首先想到的就是ELISA与Western Blot。

但是，面对难以省去的众多实验环节，

冗长的实验周期以及繁琐的操作流程，

即使是经验丰富的科研er也难免翻车。

如果此刻的你苦实验久矣，

不妨了解一下瑞孚迪HTRF技术！

Principle of HTRF

什么是「HTRF」技术？

01

原理

HTRF(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence)技术源自于诺贝尔奖成果，是一种同时兼具TR(Time Resolved，时间分辨)技术和FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer，荧光能量共振转移)技术的在均相（溶液）反应体系中的分析技术，经过三十余年的技术沉淀，已被超万篇高分文献引用。

TR技术利用稀土元素中镧系元素(Eu、Tb、Sm等)的独特性质，其荧光比普通荧光持续时间更长，普通荧光的半衰期为纳秒级，镧系元素的半衰期是毫秒级，有6个数量级的差别。所以，在检测时，每个激发光脉冲过后，通过延缓检测时间，让短寿命的荧光衰变掉后，再检测稀土穴状化合物的荧光强度，几乎可以完全消除背景荧光的干扰，提高灵敏度，反映样品的实际情况（图1）。

图1

FRET 技术（图2）利用了2种荧光基团的能量转移，这2种荧光基团分别称为能量供体和能量受体。能量供体被外来光源激发（例如氙灯或激光），如果它与受体比较接近，可以将能量共振转移到受体上，使受体受到激发，发出特定波长的发射光。当供体和受体分别与相互作用的2个生物分子结合，生物分子的结合可以将能量供体和受体拉到足够近的距离，产生能量转移。由于受体的发射光来自于能量转移，所以实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤，大大减少了实验操作步骤。

图2

HTRF技术同时应用了以上两种技术原理。能量供体选择镧系元素铕(Eu)和铽(Tb)的穴状化合物，在这个穴状化合物里，Eu或Tb被永久地嵌合在1个笼子里，结构非常稳定，对温度、pH、金属离子、螯合物等耐受性极强。HTRF的能量受体有2种，交联别藻蓝蛋白(cross-linked APC，商品名XL665)和小分子荧光探针d2，它们的光学性质相同，相对分子质量不同。前者相对分子质量为1.05×105，实际上就是改良过的别藻蓝蛋白(APC)。后者相对分子质量较小，约为1×103，可减少空间位阻对实验的可能影响, 因此应用更广泛。HTRF 测定法通过将一个供体荧光素（长寿命荧光）或一个受体荧光素（短寿命荧光）各自耦合到两个生物分子上从而来评估这两个生物分子的相互作用。当这两个生物分子靠得足够近时，通过运用320nm光源激发供体荧光素后，便能测得两种荧光染料之间的能量转移，并且受体荧光素的665nm荧光强度与相互作用的生物分子数量成正比。而将此技术运用在双抗上时，我们会使供体荧光素和受体荧光素各自与其中一种抗原蛋白相结合。当在检测体系中存在可以同时结合这两种抗原蛋白的双抗时，便能够将这两种抗原蛋白聚集到一起，并在激发下形成能量共振转移，且FRET信号与待测物浓度成正比（图3）。在检测时，通过延缓检测时间，让短寿命的荧光衰变掉后，再检测荧光强度，消除背景荧光的干扰。同时HTRF 技术在均相（溶液）中一步反应，无需包被、封闭、洗涤等繁琐的操作步骤。因此该技术具有背景低、特异性好、操作简单、体系稳定等优点。

图3

Use of HTRF products

「HTRF」产品怎么使用？

02操作

Advantages of HTRF

「HTRF」技术好在哪？

03

优势

1️⃣灵敏度高，线性范围宽；

2️⃣步骤简单：无需包被和洗板，无需避光，适用于贴壁细胞和悬浮细胞，只需将细胞进行刺激→裂解→加检测试剂→读板；

3️⃣降低背景和提高信噪比，提高灵敏度，数据真实可靠；

4️⃣实验通量高：支持96孔板、384孔板、1536孔板分析检测；

5️⃣实验体系稳定：可耐受较宽的pH范围、二价金属离子、螯合物等，并可多次读值。

Applications of HTRF

「HTRF」技术有哪些用处？

04应用

HTRF技术常被广泛用于检测可分析生物化学过程中的分子相互作用：

激酶、细胞信号转导通路

蛋白相互作用PPI(protein-protein interaction，PPI)

DNA与蛋白的相互作用

细胞毒性

受体与配体的结合

其中，供体和受体可以被用于标记各种生物分子，应用范围包括表观遗传学、生物标志物定量、GPCR信号转导等。特别是该检测技术支持强大的混合-读数模式，无需进行任何清洗步骤。这一优点连同实验的稳定性，使该技术非常适用于自动化和筛选类应用。

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05产品

瑞孚迪HTRF技术无需洗涤、操作简单、信号稳定、灵敏度高、易于自动化等优势使其成为研究药物靶标的理想的平台，被广泛应用于药物研发的不同阶段，从实验开发、药物筛选到后期验证。涉及的研究模型和靶点包括：GPCRs、激酶、表观遗传、蛋白互作、信号通路研究、细胞因子检测等。更多信息，欢迎咨询~