当前位置:首页 > 上海玮驰 > 动态资讯

Nucleofector核转染系统助力CRISPR高效率基因编辑

时间:2024-12-20 来源:上海玮驰仪器有限公司 阅读:27

在生命科学研究,临床和生物技术的各种应用中出现的多功能且易于使用的基因组编辑方法是CRISPR-Cas9。与其他基因组编辑技术(如锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应核酸酶(TALENs))相比,它具有许多优势,易于设计和使用,并具有靶向多个位点的能力。

 

CRISPR-Cas9系统基因编辑的特异性由指导RNA(gRNA)促进,gRNA与靶DNA的互补区段结合并在Cas9内切核酸酶存在下直接进行DNA切割。决定基因编辑成功的一个重要因素是将CRISPR-Cas9组分有效转入到被修饰的细胞中。一些研究已经证明在永生化细胞系中成功地进行CRISPR-Cas9介导的遗传修饰。然而,CRISPR-Cas9应用可能因转染“抵抗”而变得困难,特别是对于难以转染的细胞,例如原代细胞或多能干细胞,即胚胎干细胞或诱导的多能干细胞。如何进一步提高转染效率成为提高编辑效率的关键。

 

 

 

 

 

考虑使用RNPs

 

为了避免DNA毒性,克服mRNA不稳定性,更好地控制编辑效果,可以尝试使用RNP复合物作为转染底物。RNP在体外由Cas9蛋白和gRNA构建完成,转染后立即开始基因组编辑过程,进一步减少编辑时间。此外,使用RNP,核酸酶不会长时间保留在细胞中,最小化脱靶效应,并且剂量控制得到改善。基于RNP的转染特别有利于原代细胞中的基因编辑或难以转染的细胞,因为针对此类细胞使用DNA时会有高细胞毒性。否则使用基于DNA的方法显示出高毒性。Seki和Rutz优化了Cas9 RNP在原代小鼠和人T细胞中的转染条件,将Cas9 RNP电转到到活化的原代小鼠T细胞中实现的高敲除效率消除了进一步筛选的需要。

 

除了确定最佳转染方法之外,鉴定最佳靶向的有效Cas9蛋白和gRNA也是重要的。另外,Cas9-gRNA比率和转染的总量对于最终的结果也是至关重要的。

 

 

 

使用Nucleofector™

电转技术提高转染效率

 

有多种转染方法可以将Cas9和gRNA(或单独的crRNA和tracerRNA)转染到细胞中。最常见的是lipofection,一种基于化学的转染方法,使用脂质体递送CRISPR组分。可惜的是,这种方法的转染效率不高,尤其是对于原代细胞。也可以使用病毒载体将CRISPR底物递送到细胞中。它的转染效率比脂质体高,但设计起来很费力,并且只能转染DNA类型的底物,无法转染mRNA底物或核糖核蛋白(RNP)。

 

 

 

 

一种有吸引力的替代方案是基于电穿孔的Nucleofector™技术。它已被证明是将CRISPR底物转染到难以转染的细胞中的有效非病毒方法。Nucleofector™技术通过提供独特的电脉冲、细胞类型特异性解决方案和优化的实验方案来实现高转染效率和高细胞活力,以实现直接靶向细胞核的先进电穿孔方法。与其他方法相比,这种强大的组合可带来可重现、更快和更有效的结果,并可提供从研发到生产的多种应用规格,在疾病研究和药物发现以及基因进步方面具有广泛的应用,并推动着基因疗法、免疫疗法和干细胞生成的技术更新。

 

 

 

 

 

基于RNP与替代的转染方式(如Nucleofector电转技术)统连用的CRISPR-Cas9的基因组编辑方式,可以让研究人员优化实验以获得成功的CRISPR-Cas9基因组编辑,目前已有了显著的进展

 

 

 

2021年3月,美国斯坦福大学、贝勒医学院等全球知名机构的研究人员在国际顶级学术期刊Nature Medicine发表重磅研究论文,利用IDT的Alt-R® CRISPR/Cas9 基因编辑系统和Lonza的电转染系统,成功在小鼠模型中实现用β-珠蛋白替代α-珠蛋白来治疗β-地中海贫血

 

 

 

顶尖学术期刊《Nature》也在近期报道了一项癌症治疗领域的新突破:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,将能够精准识别癌细胞的TCR的基因序列通过CRISPR基因编辑,插入到了T细胞中。成功改造了免疫细胞,使其能特异性识别每名患者的癌细胞,并发动集中攻击。该基因编辑过程采用了非病毒性载体进行递送,能够减少安全性的隐患。这是个体化基因编辑和抗癌细胞疗法这两大热门领域的首次交汇,有望给癌症治疗带来深远的影响。

 

 

 

 

 

 

 

Nucleofector™ 技术诞生已超过20年,这是一种被引用超过 10,000 次的非病毒细胞转染方法。自开发以来的 20 年里,Nucleofector™ 技术作为有效的非病毒细胞转染方法引领市场,甚至可以用于难以转染的细胞,例如原代细胞和多能干细胞。通过使用新一代 4D-Nucleofector™平台,客户现在可以受益于改进的用户体验和针对中等通量应用的96 孔单元的完全集成。这个新版本带有一个新的设计和用户友好的实验设置和数据管理软件。4D-Nucleofector™平台客户可以期待持续的高标准性能以及更易于使用的技术支持。基于20年在外源基因转导方法的开发经验,及大量的客户反馈,Lonza开发出的4D-Nucleofector™ 以最大化的灵活性和可靠性满足客户的需求。除384-well Nucleofector外,Lonza还可以提供不同维度的转染模块来应对不同的场景需求。