纯干货！瑞孚迪HTRF磷酸化检测注意事项

细胞内信号通路，也称为信号转导级联，在感知和整合不同的外部刺激以产生生物反应方面发挥着关键作用，最终导致细胞过程（增殖、迁移、分化、营养代谢……）。磷酸化反应是由激酶介导的翻译后修饰，控制参与信号转导蛋白质的活性。因此，它是感兴趣途径激活状态的反映。

就磷酸化检测而言，最佳检测条件不仅取决于所研究的信号转导途径以及所研究的化合物（激活剂或抑制剂）的药理学特征，还取决于用于检测的特定细胞模型（贴壁或悬浮细胞、永生化细胞系或原代细胞、肿瘤、组织……）。正确优化检测条件对于确保获得最佳的试剂使用和性能至关重要。

本文以HTRF®Advanced phospho-ERK1/2kit为例，为广大研究者提供优化磷酸化蛋白检测的实用技巧，让大家更深入地了解如何优化过程中的各个步骤以获得最佳的检测结果。

图1：Process flow for detecting GPCR-mediated ERK1/2 phosphorylation.Optimize preparation of working cells

TIP1：Optimize cell density for the best signal amplitude（优化细胞密度）

HTRF信号与处理产生的磷酸化蛋白和总蛋白的量成正比，信号随着磷酸化蛋白浓度增加而增加，如果检测中磷酸化蛋白质的量明显高于孔中存在的检测抗体的量，则信号会下降（钩状效应）。有必要针对每个HTRF磷酸化或总蛋白检测试剂盒、不同的细胞模型、甚至每个实验条件进行细胞密度优化，以避免钩状效应。

图2：使用HTRF Advanced phospho-ERK1/2kit进行不同细胞密度检测p-ERK，找到检测最佳信号窗口的最优条件。每孔50K细胞密度会产生钩状效应，而每孔12.5K细胞密度条件可产生最佳信号。

TIP2：Optimize the presence of serum in the cell culture medium（血清饥饿处理）

根据要研究的信号通路，细胞饥饿处理可能有利于减少目标蛋白质的本底水平。通常情况下，从细胞培养基中去除血清是使细胞饥饿的有效方法，但对于某些细胞模型来说，血清的存在对于细胞生长或增殖至关重要。在这种情况下，可以选择将血清浓度降低至0.5% 或不高于2%，同时应优化血清饥饿的时间。

图3：在此实验中，2小时血清饥饿步骤（红色曲线）实现了最佳的p-ERK检测（S/B和EC50）。

TIP3：Distribute compounds in the presence of cell culture medium（在细胞培养基存在的情况下进行加药处理）

在将化合物/药物分配到细胞上之前，请勿从微孔板中除去细胞培养基。加药步骤中去除培养基会对某些磷酸化蛋白检测产生不良影响。在去除培养基加药的情况下，高本底水平基本上掩盖了任何诱导的药理学剂量反应的检测；当培养基存在的情况下加药时，本底水平较低并且可以检测到剂量反应（见图4）。

图4：直接加药或去除培养基后加药的检测对比。结果表明，为了正确检测剂量反应，必须在细胞培养基存在的情况下直接加药处理。

TIP4：Optimize stimulation time（化合物刺激时间）

评估化合物刺激时间，找出产生最佳信号窗口的时间。

图5：不同药物刺激时间后，使用HTRF Advanced phospho-ERK1/2kit检测p-ERK。结果表明，刺激细胞时间过短或时间过长都可能会降低信号窗口。

TIP5： Add lysis buffer shortly after removal of stimulation medium（药物处理结束后尽快加入lysis buffer）

去除刺激介质后延迟添加裂解缓冲液可能会影响化合物的剂量反应。该实验中，在去除刺激缓冲液后延迟不同时间后加入裂解液—— 5、10或30分钟。结果显示当延迟添加裂解缓冲液时，会对磷酸化ERK的检测到产生不利影响。

图6：在裂解步骤之前去除刺激缓冲液后等待时间的影响，去除培养基后必须立即添加裂解缓冲液。

通过上述实用技巧分享希望能够帮助大家获得最佳的检测结果，此外，瑞孚迪磷酸化检测不仅提供HTRF方案还有Alpha方案，同时还有干货满满的优化指南供大家参考，如有需要，就请与我们联系吧