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细胞因子释放试验——新能力,新机会,新挑战

时间:2024-11-01 来源:上海玮驰仪器有限公司 阅读:188

细胞因子释放综合征(Cytokine release syndrome, CRS)一词最早出现在90年代,当时抗T细胞抗体OKT3作为免疫抑制剂被引入临床,用于器官移植后的治疗。现在也被称为细胞因子风暴(Cytokine storms)。它是由免疫细胞过度活化引起的一种全身性的炎症反应,可由多种因素引发,例如感染,药物等。

为什么要进行细胞因子释放试验?

TGN1412是以治疗风湿性关节炎和白血病为主要目标的新型药物,2006年首次开展临床试验,6名健康志愿者在输注TGN1412后,出现了罕见的病变反应,产生了严重的细胞因子释放综合征并伴有多器官功能衰竭。这一事件也使得建立可靠的体内动物模型和体外细胞因子释放实验来预测细胞因子综合征的发生,成为临床前安全性评价的研究热点。免疫调节类的药物或疗法,例如CAR-T,含有CD3靶点的双抗,属于细胞因子释放综合症的高风险类产品。对于具有潜在风险的药物,在IND申报前,根据CDE在2020年发布的《药物免疫原性研究技术指导原则》,除了需要在常规的动物体内毒性试验中进行细胞因子相关检测外,应进行体外细胞因子释放试验[9]。

如何设计细胞因子释放试验?

由于种属的差异,动物模型可能无法完全模仿人体免疫激发的过程,因此当体内结果为阴性时,仍需设计合适的体外因子释放试验以揭示潜在的临床安全风险。一般采用人全血或人外周血单个核细胞(PBMC)评价细胞因子活化和细胞因子释放。一般来说,相比于全血,PBMC对免疫调节类的产品更为敏感,更易得到阳性的结果。但是PBMC并不能很好的模拟真实的体内环境,也可以考虑采用稀释后的全血,例如采用20%(v/v)或10%(v/v)等体积比的全血。一般而言,需要使用至少3名健康受试者的全血或PBMC来进行实验。若采用全血,不同受试者之间的变异程度可能更大,也可以考虑增加受试者的数量。一些靶点只会在特定的疾病群体中高度表达,在这种情况下,也可以使用特定疾病群体的全血或者PBMC来进行实验。

 

 

图1. TGN1412体外细胞因子释放试验的6种模型[1]

实验设计时,需要考虑固相法或液相法两种孵育体系,以尽可能模拟体内抗体呈递给T细胞的方式。NIBSC设计了6种基于PBMC的TGN1412的细胞因子释放试验实验模型[1]。方案1和2均为液相法,不同的是方案2中还引入了Anti-Fc抗体;方案3和方案4均为固相法,分别用湿法(Wet-coated)和干法(Air-dried)将TGN1412包被到细胞培养板上。方案5中将抗Fc的抗体包被到孔板后再加入TGN1412,整合了方案3和4中的方法;方案6中则引入了人内皮细胞,以模拟人体内的TGN1412和内皮细胞的相互作用。方案1和2和TGN1412临床前安全性评价中使用的方法类似,不能刺激细胞释放大量的细胞因子。当方案3不能刺激细胞释放细胞因子时,可以考虑方案4,5和6,这些方案中至少有一种能将TGN1412呈递给T细胞以提供有效的体外刺激。鉴于药物诱导细胞因子释放的机理和靶点的复杂性,还需具体情况具体分析,选择最合适的体外刺激模型。

检测哪些细胞因子?

CRS的病理生理机制尚不完全清楚。CRS通常是由于药物和细胞受体结合引起的靶效应,其抗原随后激活旁观者免疫细胞和非免疫细胞,如内皮细胞。CRS可以通过连续释放干扰素γ (IFN-γ)或肿瘤坏死因子α (TNF-α)等细胞因子直接裂解靶细胞或通过治疗性刺激激活T细胞并随后释放细胞因子来诱导。由于先天免疫细胞如巨噬细胞和内皮细胞的激活,这些细胞因子触发连锁反应,进一步释放细胞因子。IL-6,IL-10和IFN-γ是发生CRS的患者血清中持续升高的主要因子。CRS是由活化的T细胞或肿瘤细胞自身大量释放IFN-γ触发的。IFN-γ会引起发烧、寒战、头痛、头晕和疲劳,并诱导其他免疫细胞的活化,尤其是巨噬细胞[2]。活化的巨噬细胞会进一步分泌大量的IL-6、TNF-α和IL-10。TNF-α会引起和IFN-γ类似的症状。除了上述的因子外,多项研究表明[3][7][8],细胞活化也会引起IL-2的大量释放,高浓度的IL-2和IFN-γ已被认为是类似于TGN1412反应的标志[4]。IL-6则会引起严重的CRS特征性症状,如即血管渗漏,激活补体和凝血级联诱导弥散性血管内凝血等[2]。细胞因子的检测项目应与受试药物临床安全性考虑密切相关,一般情况下,观察指标包括但不限于IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α。除了上述的因子,一些药物可能也会引起其他相关的细胞因子的释放,例如IL-1b, IL-5, IL-8,IL-12,和IL-17等。因此细胞因子的选择需要根据药物靶点、靶向细胞群以及药物的作用机制等进行特异性的调整。

 

 

图2.细胞因子综合征的诱因和发生机制[2]

如何选择阳性和阴性质控?

由于细胞因子释放试验的设计多样,不同的药物在不同的体外模型中会有不同的结果,因此选择合适的阴性对照和阳性对照。阴性对照有多种选择,例如PBS,阴性对照单抗(例如Avastin),Isotype,或者用于稀释全血的细胞培养基。在细胞共培养模型中,阴性对照可能还需要包括在没有药物刺激的情况下PBMC和靶细胞共培养以及在有药物的情况下PBMC和非靶细胞的共培养。阳性对照一般可以选择OKT3(anti-CD3),TGN1412(anti-CD28),LPS,PHA,PMA和离子霉素等。除此之外,也可以根据体外模型增加相应的对照样品。