如何运用HTRF&AlphaLISA实现AAV载体的定量和空壳率计算？

基因治疗是指将正常的或者有治疗作用的遗传物质引入到患者体内使其表达从而达到治疗目的。基因治疗的关键是有效地将基因输送到靶组织/细胞，这是通过基因递送载体来实现的。腺相关病毒(AAV)载体是目前基因治疗中最常用的病毒载体之一，因其具有免疫原性低、不整合到宿主基因组、能够在体内提供长期基因表达等优点，在基因治疗中显示出巨大的潜力。

AAV是一种单链DNA(ssDNA)无包膜病毒，属于细小病毒家族，直径约25nm。目前有九种AAV血清型，每一种都有不同的嗜性，包括视网膜、肺、肌肉、肝脏和脑细胞。该病毒只由蛋白质和DNA组成，其衣壳由衣壳蛋白VP1、VP2和VP3以 5：5：50的比例构成。

在AAV药物早期开发阶段，需要在多个工艺步骤中多次对AAV载体进行定量从而不断优化工艺生产高滴度病毒载体。传统的检测方法通常耗时多，效率低，自动化程度低。Revvity公司现推出可以定量检测多种AAV血清型的HTRF和AlphaLISA试剂盒，具有操作简单，样本需求量少，线性范围宽，可实现高通量等优势。产品列表如下：

部分验证数据

HTRF AAV2 capsid detection

检测范围：4.35E+09–6.00E+11VP/mL

AlphaLISA AAV2 capsid detection

检测范围：4.5E+06–1.0E+11VP/mL

空壳率计算

在AAV载体的制造过程中，会产生三种衣壳，分别是：完整衣壳（full capsid）、部分衣壳（partial capsid）和空衣壳（empty capsid）。其中部分衣壳和空衣壳属于生产中的杂质，因此需要在整个生产过程中监测空壳率。

在这里，我们介绍一种仅需要分别检测衣壳和ssDNA的含量即可通过公式计算得到AAV样品中完整衣壳（full capsid）百分比的新方法。

所需材料

1. 已知full capsid百分比的标准品（可购买商品化标准品）

2. 待测样品

公式推导

由于partial capsid在纯化样品中的百分比小于1%, 为简化后续计算，将它排除在分析之外。

N: number of AAV capsids in the sample

Ns: number of AAV capsids in the standard

f: full

e: empty

Rp: the ratio of the concentration (c) of proteins in the sample and standard

α: each capsid is composed of α μg of total proteins

RDNA: ratio for the concentration of ssDNA in the sample and standard

βs：the standard comes with a known percent of full capsids

通过以上公式换算便可得到样本中full capsid的比例β

根据上述公式，我们可以通过运用HTRF或AlphaLISA的AAV定量试剂盒分别检测样本和标准品中衣壳数量，通过比值得到Rp。再通过LabChip、qPCR等其他ssDNA检测手段分别检测样本和标准品中ssDNA的浓度，通过比值得到RDNA。这样通过引入标准品采用比值法，便可以显著降低不同检测方法之间的不匹配度，得到更加准确的结果。