重磅推出 | Beacon亲和力评分上市，抗体选择不再“随机”

Beacon®单细胞光导系统与Opto® B Discovery抗体发现试剂盒让研究人员能够在一周内从多个物种中发现和筛选出功能性候选抗体（图1）。为生物制药企业、科研实验室和CRO的研究人员提供前所未有抗体药物早期发现工具。Beacon®高通量的单B细胞抗体发现方式可能会在初期识别出数百至数千个抗原结合抗体。研究者可以利用OptoSelect芯片上的多轮筛选提高聚焦度。如果只是基于结合实验进行随机选择，往往需要重组表达众多的抗体候选分子（hits），再经历重组表达和大量的验证后才能缩减到少数进入下游的先导抗体（leads）。

布鲁克细胞分析的研发团队基于现有的结合检测，开发出Beacon亲和力评分（Beacon Affinity Score）分析方法，在抗体筛选初期就能够完成对上万个抗体的亲和力评估。通过对在纳摩尔至皮摩尔范围亲和力的结合抗体进行排序，让使用者不再随机选择hits，而是根据亲和力排序选择最具潜力的候选序列进行下游验证。这将在不增加额外成本的情况下，帮助科学家增加评估维度，减少后续验证压力，提升功能抗体开发的成功率。此外，Beacon®平台生成的大量数据为人工智能和机器学习的模型优化添砖加瓦，或将带来抗体工程和抗体开发领域革命。

图1.利用Opto® B Discovery亲和力分析开展抗体发现。在一周内实现从多种物种B细胞无损克隆、功能优先的单B细胞筛选（包括相对结合亲和力）、以及回收单克隆抗体序列。

芯片上抗体功能筛选的实验设计

可溶性抗原的相对亲和力排名能够与使用Cell Analysis Suite（CAS®）软件3.2+版本的所有物种Opto® B Discovery工作流程兼容。它还能用于杂交瘤或其他抗体分泌细胞系（如瞬时转染细胞）的筛选。在芯片上完成单B细胞克隆后，使用多重荧光延时成像筛选抗体分泌细胞。检测时需使用（i）包被有物种特异性IgG捕获抗体的6-8µm检测微珠；（ii）不同荧光基团标记的抗原和IgG二抗（图2a）。通过使用IgG捕获微珠，我们分别量化分泌的抗体量以及与抗原的结合量，进而评估结合强度（图2b）。单B细胞分泌的抗体在NanoPen小室开口处及其周围被微珠捕获，分泌的抗体量与抗IgG二抗荧光强度等比例增强。抗原的荧光也因为抗体分泌量以及抗体结合亲和力的差异显示出不同的荧光强度（图2c）。

图2. 基于微珠的多重检测用于快速获得Beacon亲和力评分。A) 相对亲和力排名的捕获测定试剂将抗IgG包被的珠子、荧光素标记的抗原和荧光素标记的二抗结合。B）检测微珠和试剂被导入到OptoSelect® 芯片通道中。C) 使用多重荧光延迟成像来可视化在B细胞的NanoPen上方IgG分泌（绿色）和抗原特异性捕获（品红色）。

创新的抗体荧光定量方法用于亲和力评分

Beacon®单细胞光导系统能够自动识别数百至数千个结合抗体信号。完成初步分析后，CAS软件利用机器学习算法识别分泌抗原特异性抗体的B细胞的NanoPen小室。除了识别阳性hits外，软件现在还能够自动计算IgG和抗原bloom的基于荧光的评分（图3a）。该评分利用新开发的计算模型，根据荧光产生的时间、扩散的速度以及强度，得出IgG评分以量化捕获的抗体量。相似的，抗原评分则将分泌抗体捕获的抗原量进行量化（图 3b，黄色文本）。然后在Assay Analyzer™中通过IgG评分对抗原评分均一化（抗原评分 ÷ IgG评分），得出Beacon亲和力评分，为抗体与抗原的结合强度提供相对测量（图3b，白色框）。

图3. Beacon亲和力评分通过IgG分泌将抗原结合进行均一化。A) IgG荧光强度与距离的扩散拟合曲线。从蓝色到红色的色梯表示时间进展。插图为IgG分泌的显微图。B) 同一NanoPen上IgG（绿色）和抗原（品红色）评分（黄色）以及对应的Beacon亲和力评分（白色框）。

Beacon亲和力评分的验证

为了验证亲和力评分的效能，我们对六种分子量在18.6 kDa到125 kDa的可溶性抗原（TIM3、VEGFR2、IL6、IL10、IL17A和GMCSF）开展Opto® B Discovery抗体发现，抗原特异性抗体被随机导出，这些抗体分的Beacon亲和力评分随机分布正在较广范围内（图4，黑色轮廓点）。

图4.对VEGFR2、TIM3、IL6、IL10、IL17A和GMSCF的抗体筛选进行Beacon亲和力评分，并按每个实验中的相对排名绘制。数据点从蓝色（低亲和力）到黄色（高亲和力）着色。黑色轮廓点表示未排序导出的前48个hits，显示出随机分布在总评分范围内。紫色框中的数据显示了如果按Beacon亲和力评分排序的前48个hits。百分比表示这些前48个hits与随机选择的hits的重叠比例。

我们针对每种抗原都选择不同Beacon亲和力评分的抗体进行重组表达，并使用生物膜干涉技术（BLI，Octet）对选择的抗体进行亲和力测定。实验结果显示Beacon亲和力评分与实验验证的KD值具有相关性（图5）。在不同的抗原中，我们发现亲和力的范围各不相同，有些范围广泛（例如，VEGFR2和TIM3，100 pM至100 nM），有些非常狭窄（例如，GMCSF，1 nM至15 nM）。我们通常可以区分亲和力小于1 nM（图5，黄色数据点）的抗体组与亲和力大于10 nM（图5，蓝色数据点）的抗体组。

图5.Beacon亲和力评分与实验验证的KD值相关。Beacon亲和力评分（y轴）与验证的KD值（x轴，Log10 刻度）相关联。虚线表示线性回归拟合，Spearman相关系数（rho）和p值揭示了不同的相关性。

基于Beacon亲和力评分对hits进行排序的能力对于具有广泛抗体亲和力范围的抗原（如VEGFR2和TIM3）更为稳健；然而，当抗体的亲和力范围狭窄时（如针对GMCSF的抗体），排序的能力则相对有限。需要注意的是，Beacon亲和力评分是单一抗原测定内的相对测量，并非对亲和力的绝对定量。尽管存在这些局限性，Beacon亲和力评分在不增强额外成本的情况下提供提前筛选抗体相对结合强度的机会。

使用高级可视化方法探索抗体库

研究人员可以利用Beacon亲和力评分来深入了解抗体库，如应用UMAP等可视化手段，来分析获得的抗体序列（图6）[1]。通过将Beacon亲和力评分与抗体氨基酸序列分析相结合，研究人员可以识别候选抗体的多样性和高亲和力抗体的聚类，探索编码序列相似性与结合强度之间的关系，并选择多样化的候选抗体进行进一步表征。这种可视化和分析抗体库的方法展示了Opto® B Discovery平台生成的定量亲和力数据如何与下游分析集成，以实现更有信息量和更高效率的抗体选择。

图6. VEGFR2特异性抗体序列的UMAP可视化。每个点代表一个单独的抗体氨基酸序列，按Beacon亲和力评分（蓝色至黄色渐变）着色。星星表示BLI验证亲和力的抗体：黄色（KD <1 nM），灰色（KD 1-10 nM），蓝色（KD >10 nM）。这种可视化使得探索序列多样性、亲和力聚类和选择最佳抗体候选成为可能。

小结

布鲁克细胞分析的Beacon®单细胞光导系统和Opto® B Discovery工作流程可以在单日内筛选多达数千个抗原特异性hits。创新的Beacon亲和力评分算法提供对相对亲和力的定量数据和排序，让抗原抗体结合检测实验附加上更大价值。对分子量在18.6 kDa至125 kDa范围内的几种可溶性抗原的验证数据显示，其相对亲和力排名与行业标准方法测量的解离常数具有很好的相关性。对抗体结合亲和力的早期洞察将提升抗体筛选效率，增加抗体开发过程中下游成功的可能性。