以“核苷酸-PARP1-HPF1”三元复合物抑制剂筛选为例
ADP-核糖基化酶[Poly (ADP - ribose) polymerase-1 (PARP1) ]是一种在哺乳动物细胞核中高度表达的DNA修复酶。当DNA发生损伤时(如单链和双链DNA断裂,single and double strand DNA breaks,DSB/SSB),PARP1及同源物PARP2作为DNA损伤的第一响应者,会最先被损伤的DNA招募到损伤位点,以NAD+为原料对组蛋白和其他底物进行单体和多聚核糖基化(PARylation)修饰,然后募集其他DNA修复蛋白到损伤位点共同修复DNA损伤(如图1)。
图1:PARP修复单链断裂DNA示意图 (Cortesi, Rugo et al. 2021)
PARP1在DNA修复中的关键作用,为研发PARP1抑制剂治疗恶性肿瘤提供了理论依据,即合成致死。特别是双链断裂(DSB)修复缺陷的癌细胞,如BRCA1/2突变细胞。基于“合成致死”机理,PARP抑制剂通过与PARP1或PARP2催化位点结合,导致PARP蛋白无法从DNA损伤位点上解离(Dissociation),束缚在DNA上的PRAP在DNA复制时会导致DNA复制叉停滞,进而导致DNA复制无法顺利进行,正常细胞可以通过同源重组修复机制修复DNA双链损伤,而BRCA缺陷(HR缺陷)的肿瘤细胞则不能及时修复,该DNA断裂便转化为致死性双链断裂,导致肿瘤细胞死亡。所以BRCA1/2突变的细胞对PARP1抑制剂格外敏感。PARP1也成为炙手可热的癌症治疗靶点,已经有多款小分子PARP1抑制剂(PARPi)药物上市,包括奥拉帕利、鲁卡帕利、尼拉帕利、他拉唑帕利、氟唑帕利、帕米帕利等。国内由齐鲁制药开发的奥拉帕利仿制药(齐帕尼®)也已正式开售。
研究表明,DNA损伤特异的PARylation修饰多发生在底物的丝氨酸残基上,这一过程需要HPF1(PARylation Factor1)辅助因子的协助。HPF1可指导PARP1/2以NAD+为原料对底物蛋白质中KS motif中的丝氨酸(Ser)残基进行修饰。HPF1和PARP1/2残基共同形成的酶活性位点对于细胞中DNA损伤诱导的PARylation至关重要(Suskiewicz, Zobel et al. 2020)。因此,有研究者认为抑制剂应靶向PARP1-HPF1,而不仅仅是PARP1 (Rudolph, Roberts et al. 2021)。且鉴于PARP1抑制剂存在的临床问题,如大约40%的BRCA1/2突变癌症患者对PARP1抑制剂具有一定的抗药性(Li, Liu et al. 2020),那么基于PARP1/2-蛋白复合体的药物研发,相比单独的PPRAi而言更有现实意义。
Kellett等人开发了一种基于PARP1–HPF1复合体的高通量药筛体系进行药物筛选(Kellett, Noor et al. 2023),其基本原理如图2所示:
图2:荧光标记的核酸-PARP1-HPF1三元复合物药筛模型示意图
筛选用的复合物由一段荧光标记的核苷酸(18mer , 5′ - phosphate -5′ - fluorescein -GGGTTGCGGCCGCTTGGG-3′),PARP1蛋白和HPF1蛋白构成。当反应体系内存在PARPi或无NAD+时,PARP1&HPF1复合物无法从核酸上解离,从而形成稳定的荧光核苷酸-PARP1-HPF1三元复合物,测定该体系的荧光偏振值时,其数值将偏小;而如果存在有NAD+和PARPi时,则会发生PARyation效应,导致PARP1&HPF1复合物从荧光核苷酸上解离,此时反应体系内存有丰富的荧光小核酸片段,测定该体系的荧光偏振值时,数值将偏大。通过偏振值的大小,即可进行高通药物筛选。
研究人员分辨测试了一个已知的PARP-1 Targeted Library(OTAVAchemicals,包含470个化合物)和一个未知的ChemBridge diversity library(包含10000个化合物),均取得良好的结果。
实验使用瑞孚迪的高通量药筛整合系统完成,主要的设备包括JANUS G3液体处理工作站(瑞孚迪),STX500-DF Deep Freezer -20℃低温冰箱(Drug Library freezer,LiCONiC),Envision 高通量多功能微孔板检测仪(瑞孚迪),FlexDrop iQ纳升加样器(Drug Printer,瑞孚迪),细胞培养箱(LiCONiC),Phenix Plus(瑞孚迪),封膜机(Azenta),Hotel(LiCONiC)等设备组成(如图3)。
图3:全自动高通量筛选系统布局图
化合物存于80% N2低温冰箱中,筛选共使用了32块384孔板完成,每块板包括阳性孔,阴性孔和化合物样本孔。样本孔包含binding buffer24.5μL,PARP1-HPF1-DNA复合物12.5μL,NAD+12.5μL,化合物0.5μL(终浓度20μM)。binding buffer,PARP1-HPF1-DNA复合物,NAD+均使用GANUS G3进行加样,化合物使用FlexDrop iQ加样,体系室温反应15min后,在Envision上进行荧光偏振检测,激发482nm,发射530nm,二向色镜D496。
检测结果,所有孔板的Z’-Factor均值为0.64±0.09,表明该筛选方法建立成功。3SD内的苗头化合物(Hits)有187个(图4)。
图4:Z’和SD数值
使用高通量药筛系统Cherry-picked功能,从化合物源板中自动挑选出这187个化合物,之后使用FlexDrop iQ进行梯度稀释加样,每个化合物作4个浓度梯度(20nM,40nM,80nM,160nM),3复孔做剂量效应反应实验,结果表明166个化合物具有良好的剂量效应反应关系,其中8个代表性的化合物(编号4, 60, 88, 89, 110, 116, 145, 151)剂量效应如图5和表1。
图5:8个代表性化合物剂量效应曲线
表1:8个代表性化合物IC50
Compound ID | IC50 (μM) |
4 | 1.07 |
60 | 7.77 |
11 | 13.55 |
89 | 13.79 |
110 | 20.44 |
116 | 22.63 |
145 | 36.82 |
151 | 40.7 |
使用JANUS G3工作站将18000个SUM149PT细胞系接种于96孔PhenoPlate中(瑞孚迪),之后通过机械臂移动至自动培养中过夜培养,并进行换液,染色,然后使用Phenix Plus高内涵成像系统拍照,对筛选出的8个代表性苗头化合物(两个浓度梯度,10,12,5μM)进行PARylation功能验证,结果表明4, 88, 145三个化合物对PARylation效应具有明显的浓度梯度效应,其中化合物4的效果最为明显(图6)。进一步使用类器官模型验证化合物4的药物毒性(CellTiter Glo3D,Envision化学发光检测),结果表明其具有明显的浓度梯度杀伤效应,IC50为251μM(图7)。
图6:PARylation验证(抗体荧光染色)
图7:类器官药物毒性验证
该研究项目中,研究者使用瑞孚迪的高通量药筛整合系统,开发了一种新的居于荧光标记的核苷酸-PARP1–HPF1三元复合物的药筛模型,对10000种化合物进行筛选,得到187个3SD内的Hits。系统整合了大量瑞孚迪的设备和仪器,包括中控软件,机械臂,JANUS G3液体处理工作站,Envsion高通量多功能检测仪,Flexdrop iQ纳升移液器等,可以对药物进行全自动溶解,存储,加样,Hits挑选,梯度稀释,细胞铺板,细胞培养与换液,高内涵成像检测,活性评估等,系统功能强大,自动化程度高,重复性好,是药物筛选的强大利器。作为全球药筛的领跑者,瑞孚迪还具有丰富的药筛耗材和试剂,可为药筛客户提供全面的解决方案。
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