Nature Genetics |单细胞光导系统拆分单次有丝分裂姐妹细胞，分析急性和慢性DNA突变及修复

癌症的发展和进化通常是由突变的积累驱动。这些突变可能由多种来源引起，如暴露于紫外线和氧化应激等。然⽽同时发⽣的基因毒性事件导致的DNA碱基受损如何导致突变尚不完全清楚。德国癌症研究中心和爱丁堡大学的研究者近期在Nature Genetics（IF=30.1）上发表最新研究成果。他们提出一种新的策略，能够在单细胞有丝分裂期间和单链分辨率下解析并量化单个细胞基因组进化的不同机制。

为区分慢性（活性氧，ROS）和急性（紫外线，UV）诱导的突变，研究者使用布鲁克的单细胞光导系统将单个细胞在经历急性UV损伤后第一次有丝分裂得到的两个姐妹分离开。借助单细胞光导系统对单个细胞的精细操控和培养，研究者发现UV诱导的突变为姐妹细胞特异性事件，揭示全基因组的镜像突变。这项研究也让当前的转录相关ROS修复模型得到完善，证明了UV损伤的持续性，并对预测的损伤分离模型得到实验验证。研究者进一步利用F1杂交小鼠在体内证明可以将突变定相到肝肿瘤的单链DNA上。

该研究提出的体外和体内研究策略可被广泛应用于分离和分析驱动癌症基因组进化的探索中。

图1. 急性和慢性损伤来源的基因组突变定相模型。

a.在有丝分裂姐妹细胞之间创建镜像突变模式的突变分离模型。b.模型系统，用于研究ROS突变的逐渐积累和急性突变压力。实验包括标准细胞培养到紫外线照射，单细胞分选以及在第一次有丝分裂后将两个姐妹细胞分离到单独小室中，最后进行细胞增殖。

建立系统：

利用单细胞光导系统分离单次有丝分裂后的姐妹细胞

研究者利用单细胞光导系统在一次有丝分裂后物理分离两个哺乳动物姐妹细胞。这让测试有关DNA损伤和修复的几种假设成为可能。布鲁克的单细胞光导平台通过光电定位技术实现对单个细胞进行无损操作，将细胞移动到芯片上的小室当中（图1b）。该平台可以在一次有丝分裂事件中进行延时成像追踪细胞周期，在有丝分裂技术后物理分离姐妹细胞，并在芯片上对分离的细胞进行增殖培养。随后将扩大的克隆群体导出到96孔板上并进行全基因组测序（WGS），使研究者能够确定这些姐妹细胞的突变情况。仪器配备的软件能够对细胞增殖进行计数，在优化的培养条件下，细胞分裂的速度与标准细胞培养中测量的速度相当。

图2. 利用单细胞光导系统在哺乳细胞中区分慢性和急性突变。

为了控制倍性和细胞周期，研究者通过慢病毒转导将FastFUCCI载体整合到小鼠细胞系P388D1中。FUCCI（Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator）使用在细胞周期特定阶段降解的荧光团组合以标记细胞所处的细胞周期（图2b）。布鲁克的单细胞光导系统配备了与FUCCI荧光团兼容的激光器和荧光通道，可观察到PF1细胞的细胞周期从G2/M期（绿色）到G1期（红色）状态之间的切换。

姐妹细胞分析区分渐进和急性诱变过程

研究者使用3秒的UVC照射细胞，导入进OptoSelect芯片上后选择了7个经历有丝分裂的细胞，并将来自7个独立有丝分裂的14个子代姐妹细胞扩展为足够大以进行全基因组测序的克隆集落。通过区分ROS和UV造成的不同突变特征以及突变频率对不同的基因诱变过程进行区分。研究者发现，独立克隆之间共享的突变很少见，这表明每个克隆都是独特进化轨迹的结果。UV突变对于每个姐妹细胞来说都是独特的，而ROS突变可以细分为祖先突变和姐妹特细胞异性累积突变（图3）。

图3. 分析急性和慢性突变过程

有丝分裂姐妹细胞中的镜像突变定相

在紫外线损伤后的第一次有丝分裂中，含有互补损伤的DNA链会分离成单独的子细胞（图4a）。如果发生姐妹染色单体交换（SCE）事件，受影响染色体上的等效位置显示有丝分裂姐妹之间从混合不对称到相反不对称的转变（图4b）。分析结果表明，所有七对有丝分裂姐妹细胞在其基因组中都表现出镜像突变的不对称性（图4d）。

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图4. 有丝分裂姐妹细胞在整个基因组中具有镜像突变分布。

此外，研究者还揭示紫外线损伤可以持续一个以上的细胞周期，从而驱动CC二核苷酸的多等位基因变异。慢性ROS损伤在阶段性突变或转录相关修复中并不表现出链特异性。最后，研究者利用两个SNP相差较大的亲本小鼠进行杂交和化学诱变剂诱导，在单个染色单体水平上证明，几乎所有突变都在F1小鼠的肿瘤中定相到一条DNA链上。

“这种巧妙的方法能够追踪单个受损细胞有丝分裂后的突变。通过这种方式，它有助于解决细胞如何接收和管理不同诱变剂留下的基因组疤痕。我们认为，这项技术对于那些有兴趣了解和比较突变过程的人来说将是无价的。”

Saia Danovi，《自然遗传学》高级编辑

“这是一篇令人振奋的论文，我期待其见诸出版。作者介绍了他们开发的在单个细胞分裂过程中追踪突变（由诱导或者慢性突变引入）的研究方法。这一创新方法依赖于在受控的细胞分裂次数后通过微流控技术将细胞进行分离。这项研究成果具有很大影响力，实验严谨，采用的方法和模型都极具创新性。“

John Maciejowski, MSKCC研究员

小 结

癌症基因组进化被认为是达尔文过程，其中随机突变和选择压力决定克隆扩增。该研究方法分离有丝分裂后的姐妹细胞，并将突变压力与正选择解耦，从而实现两个等位基因的正向和反向链的命运跟踪。

布鲁克的单细胞光导平台的关键贡献在于它允许研究人员精确地操控单个细胞，在单次有丝分裂后物理分离姐妹细胞，并能在OptoSelect芯片上实现单细胞的培养。通过优化的细胞培养条件，能够让细胞在芯片上以接近常规细胞培养的速率增殖，同时保持基因组的二倍体状态。布鲁克的单细胞光导技术使用不仅解决了细胞周期状态、细胞分裂次数和扩增速率的准确分析问题，而且使对细胞系进行遗传改造并施加多种诱变剂的测试成为可能。