内毒素检测实用问答③ | 低内毒素回收(LER)十问十答

低内毒素回收(LER)

内毒素检测Q&A③

内毒素检测在现代生物制品和医药领域中扮演着至关重要的角色，注射类药物、注射器具，植入医疗器械等都有相应的质量标准，用以确保产品安全性。然而，在进行内毒素检测的过程中，许多实验室和研究人员可能会面临一系列挑战和疑惑。

Lonza作为内毒素检测领域的专家，特此为大家带来内毒素检测问答系列，本系列文章旨在解答您在内毒素检测中可能遇到的常见问题，提供实用建议，帮助您更好地理解并成功应对内毒素检测过程中的关键问题。

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第三期的主题是一直备受关注的低内毒素回收(LER)，本期将一次性放出十道热门问答，如果你还有其他疑惑，请在评论区留言。

1. 为何LER对生物制品生产非常重要？

法规要求生物制品需要通过兔热原实验检测热原含量以确保产品的安全性。如果能够证明细菌内毒素测试与兔热原等效，则可使用细菌内毒素测试代替兔热原进行检测。需要注意的是，某些生物制品使用内毒素检查法检测时会存在LER效应，生产厂家需要使用兔热原进行检测。

为了确认LER是否和体内的非内毒素热原一样产生致热反应，法规要求生物制品制造厂家进行加标(Hold-time)研究，并且，相同时间点也需要进行兔热原检测。

2. FDA对LER持什么样的态度？

LER主要与生物制品有关，主要是单克隆抗体及一些治疗用融合抗体。加标(Hold-time)研究表明LER不仅仅受到赋性剂的影响，蛋白浓度、内毒素检测方法、检测试剂的供应商、Hold-time研究所用温度及时间都是影响LER的主要因素。此外，加标内毒素的种类(RSE, CSE, NOE)也会影响最终结果。

3. 怎样进行Hold-time研究？

1

向未稀释样品中加入一定浓度的内毒素 (加标内毒素浓度≤样品释放限值)

2

根据测试样品信息确定hold-time研究参数（温度，容器类型，考察时间点）

3

在特定的时间点进行内毒素检测 （例如：4小时，24小时，72小时，5天，7天）

4

计算回收率

4. FDA对于Hold-time研究有哪些建议？

FDA对于Hold-time研究的建议总结如下：

1

至少进行3批产品的验证

2

添加内毒素浓度≤样品的释放限值

3

对于产品的研究至少8天

4

使用工作标准品作为最差条件进行研究

5. 天然来源内毒素(Naturally Occurring Endotoxin , NOE)和标准内毒素的区别？

天然来源的内毒素(NOE)是从革兰氏阴性菌中粗提出来的内毒素。与RSE或者CSE不同，天然来源的内毒素(NOE)是不经过纯化的内毒素。与RSE或者CSE相比, NOE不容易导致LER，这可能与NOE为非精制提纯内毒素，含有蛋白质和细胞碎片物有关。

6. 与RSE或者CSE相比，使用NOE进行研究是否有优势？

从提交给FDA的几个BLA汇编数据来看（见表一），不论内毒素来源如何，即不论使用CSE或者是NOE，细菌内毒素测试和兔热原检测结果都存在冲突。这些数据从另外一方面表明，即使使用内毒素检测产生了LER现象，兔热原检测依然能够检测样品是否会引起热原反应。正是因为这个原因，FDA不支持或不鼓励在Hold-time研究中使用NOE。此外，每种NOE从不同的菌种中制备并且菌种也会受到不同生长条件影响。所以，如果没有NOE的标准化制备流程，监管机构无法判断NOE 是否能够有效代替标准内毒素。

▲ 表一：提交给FDA的BLA数据摘要

目前有一些研究学者在Hold-time研究中使用了NOE，并且获得了较好的结果。并且结果发表于2015年9月的美国药典论坛，该论文的主要观点为：与标准内毒素相比NOE更加稳定并且引起LER的可能性更小。

然而，也有研究学者对此持反对意见。因为实验结果表明，某些未稀释样品中添加的NOE或者CSE/RSE 不能回收回来。因此，关于NOE 能够成功解决LER问题仍然未有定论。

7. 是否可以使用分散剂解决LER问题？

有一些样品能够使用分散剂，例如PyroSperse™来解决LER问题。然而，由于每个样品出现LER问题的原因都不尽相同，所以分散剂并不能解决所有问题。当出现LER问题时可以先使用分散剂如PyroSperse™来进行摸索研究，如果分散剂不能解决问题，则需要探究其他样品前处理方式。

8. 解决LER问题的样品前处理方式有哪些？

解决LER问题的主要思路为去除遮蔽现象。主要处理方式包括：

1

调节pH，影响氢键

2

添加Mg2+/Ca2+，防止螯合剂螯合内毒素聚合物中的二价离子

3

使用分散剂PyroSperse™，干扰内毒素聚集

9. LER是否有潜在公共安全性问题？

FDA对于LER及其与药物安全性的相关性问题持保守谨慎态度。尽管目前没有报道表明LER有公共安全问题，但是FDA担心某些药物会因为LER问题不能通过USP<85>检出内毒素，从而引起人体热原反应。

10. 有哪些组织正在帮助医药生产商研究LER问题？

PDA(Parenteral Drug Association)以及BPOG(Biophorum Operations Group)均成立LER研究工作组，用于研究LER的影响以及解决LER问题的方案。试剂供应商、内毒素检测终端用户与全球监管机构紧密合作，共同调查并给出受LER影响的产品的建议。