如何做好生物发光小动物活体成像实验？

小动物活体成像技术是指利用一套非常灵敏的光学检测系统，在不损伤动物的前提下，对活体状态下的生物体内的组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。通过这项技术可以非侵入式、直观地观测活体动物体内肿瘤的生长及转移，感染性疾病的发展过程、特定基因的表达变化等生物学过程。

活体光学成像技术，主要包括生物发光（Bioluminescence）与荧光（Fluorescence）两种技术。生物发光技术是用荧光素酶（Luciferase）基因标记细胞或者DNA，而荧光技术则是应用荧光蛋白（如GFP,RFP,Mcherry等）标记细胞或蛋白等研究对象。其中生物发光技术因其操作简单，背景噪音低，灵敏度高，结果直观等优点，在肿瘤，分子互作及信号传导等研究中得到了广泛应用。

荧光素酶报告基因

报告基因（Reporter Gene）：通常指可编码某种蛋白或酶，其表达产物容易被检测，并且能与内源性背景蛋白相区别的基因，通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控。

理想的报告基因必须具备哪些条件？

1.编码的表达产物必须与细胞内源性的所有基因相区别，编码产物的活性不受宿主细胞的干预。

2.有快速简便、经济、灵敏的检测方法，且重现性好、结果可靠，测量数据应该有较宽的线性范围。

3.细胞内的其他基因产物不会干扰报告基因产物的检测，同时报告基因的表达也不改变宿主细胞的生理功能。

常用的荧光素酶有哪些？

荧光素酶（Luciferase）是自然界中能发出荧光的酶的统称。他们可以通过酶促反应催化底物产生自发荧光。荧光素酶因其便于检测和灵敏度高等特性常作为报告基因被广泛用于生化检测实验中。其中应用最广泛的是萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase）。

萤火虫荧光素酶的发射波长560nm,在体内会红移至610nm,组织穿透性更好，适用于动物内脏等较深部位的组织成像。优点包括底物不产生本底光源，底物干净，对照组的设置就相对容易。但缺点也有，相对分子质量较大，在62-64kDa，不适宜转一些小细胞或细菌，影响表达效果；同时，需要镁离子及ATP的参与才能发生酶促反应产生发光现象，一些能量代谢，对镁离子或ATP特别灵敏的实验，要注意检测手段对结果波动的影响。但普通的肿瘤或干细胞检测，则不影响检测效果。

海肾荧光素酶的发射波长480nm，此波段小鼠的皮肤、毛发、血液、脏器对光的吸收较强，因此其产生的蓝光组织穿透能力较弱，适用于动物浅表组织成像；优点是相对分子质量较小，可用于一些小的细胞及细菌，发光过程不消耗ATP及镁离子。但缺点是底物会有一定的本底光源，底物打入小鼠后，也会有微弱的信号，此时对照组的设置要求相对就严格一些。

根据实验目的，合理设计我们的实验方案，选取合适的荧光素酶，建立稳定的细胞系及转基因动物后，注射适当的生物发光底物即可进行活体成像设备的拍摄研究。

活体成像生物发光的标记原理

活体动物生物发光成像，是将荧光素酶基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素（luciferin），即可在几分钟内产生发光现象。当底物过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关性，检测方便，定量准确，在生物技术领域有非常广泛的应用。

常用的底物给药方式有腹腔注射和尾静脉注射

腹腔注射：迅速分布全身，并穿过包括大脑在内的血液组织屏障；注射底物后10～20 分钟进入成像平台期，发光信号达到峰值并逐渐减少；2h后信号消失，不可检测。

尾静脉注射：可提供更高的发光强度，5～10倍的高信号，但是注射难度较高，代谢快。底物注射后约2min进入信号峰值，约30min后信号消失。

建议：第一次使用荧光素酶底物成像，或者更换新品牌底物，需要进行预实验，观察底物在何时达到峰值。确定注射荧光素底物和成像之间的最佳延迟，然后将此时间用于所有实验，以标准化成像数据。生物发光信号的动力学具有组织依赖性。建议每5-10min对动物进行一次成像，最多40min，为每个新建模型创建一个发光动力学曲线。常见信号峰值时间点在10-15min左右，荧光反应发光一般在30min后衰减，3h后完全消失。

逐典D-荧光素钾盐

逐典D-荧光素钾盐，其优点在于纯度高（HPLC>=99%）,经验证的优异的生物发光性能，以及高溶解度。游离形式的荧光素溶解度较差，而钾盐形式能做到较好的水溶性，逐典开发的高纯度D-荧光素钾盐溶解度可达40mg/ml以上。活体成像试验中，建议注射量在150mgD-荧光素钾盐/kg鼠体重（如对于体重为10g 的小鼠，需要注射100 μL 以提供1.5 mg D-萤光素钾盐）。

IVIS Lumina III 小动物活体成像平台

IVIS Lumina III是Revvity推出的第三代小动物活体光学二维成像平台。该系统秉承了前几代IVIS系列共有的作为业内金标准的高灵敏度生物发光二维成像性能，并且进一步优化了荧光二维成像性能，将滤光片标准配置数量增加至26个，同时引入了作为荧光多光谱成像金标准的纯光谱分析技术（CPS），使得Lumina III成为同时拥有生物发光及荧光二维成像金标准的高性能活体成像平台。

主要特点

•高灵敏度生物发光二维成像

•高性能荧光二维成像,配备高品质滤光片及专利的光谱分离算法，可实现自发荧光扣除及多探针成像

•基于切伦科夫辐射原理的放射性同位素成像