支原体快检，让细胞培养得到有效的保护

细胞培养在科研和生物制药中被广泛应用，支原体污染问题频繁出现，污染会影响细胞的生长、形态、生化特点和遗传特征。因此，为了提高生物制品的有效性和安全性，各国监管机构和法规都建议使用适当的检测方法对细胞进行检测，以确保使用的细胞无支原体污染。

迄今为止，已经有多种支原体检测方法，包括培养法、指示细胞法、基于核酸扩增（NAT）的方法和基于酶促反应的方法（生化法），每种方法都有各自的特点和应用范围。培养法作为经典方法，通过有无支原体生长进行判断，最直接，但是检测时间是一个最大的挑战；指示细胞法检测时间稍微有所缩短，但是灵敏度是一个问题。NAT方法检测时间短，是直接对支原体的核酸进行扩增，但是覆盖率和准确度以及对死活支原体的区分有一定的挑战；基于酶促反应的生化法检测的时间最短，对活的支原体进行检测，灵敏度适中。

生化法是基于支原体的生化活性的检测方法，相关试剂盒可检测支原体酶，如乙酸激酶和氨基甲酸酯激酶。这些酶能够在磷酸乙酰基和磷酸氨基甲酰基底物存在下催化ADP转化为ATP，进而在荧光素酶作用下使得荧光素底物反应释放化学发光信号。灵敏度较高、准确、特异和快速（20mins）是生化法检测的主要优点。推荐用于细胞、培养基、血清等样品的快速污染检测和筛查。

生化法检测原理：

表1常见三种支原体检测方法的比较

题为“Sensitivityof biochemical test in comparison with other methods for thedetection of mycoplasma contamination in human and animal cell linesstored in the National Cell Bank of Iran”论文采用培养法、生化法（LonzaMycoAlert®试剂盒）和PCR法对细胞库大量的细胞进行污染检测，并对这些方法的敏感性、特异性、准确性和便捷性（速度）进行了比较，认为MycoAlert生化法由于其灵敏度、特异性和检测速度的多方面优势，可被视为传统微生物培养和DNA染色荧光染料方法的替代方法。这与美国药典（USP）的描述内容一致，“Avalidated nucleic acid amplification technique(NAT) or an enzymaticactivity based method may be used to detect Mycoplasma”[1]。

该研究中，研究人员随机选取了40种不同的人和动物细胞系，分别以Vero和NSO细胞系为阳性和阴性对照，使用培养法、生化法和PCR方法进行支原体检测。结果汇总如下：

表2三种方法检测结果

检测结果进行SPSS统计学分析并以培养法为参照，计算阳性和阴性结果的敏感性、特异性、准确性和预测值，统计结果见图1。

图1.三种支原体检测方法在特异性、敏感性和准确性参数上的统计学比较由此结果可以看出：生化法具有出色的灵敏度、准确度、特异性，而且检测时间短（＜20mins），可以成为培养法和染色法的较好替代。该方法只能检测活的支原体，因此可以跟PCR法形成较好的检测互补。

研究中所使用的生化法试剂盒MycoAlert来自于Lonza,作为业内最经典的生化法支原体检测试剂盒，其检测灵敏度为＜50cfu/mL，对A.laidlawii、M.hyorhinis和M.orale的灵敏度为10~20cfu/mL[2]。

图2.MycoAlert®试剂盒检测示意图和灵敏度结果

目前Lonza已经推出了升级版本的支原体试剂盒MycoAlert®Plus，除了可以在Lonza Lucetta™ 2检测设备之外，由于其更佳的检测灵敏度，还可以使用各种酶标仪进行高通量支原体检测[3-8]。

产品特点：

• 简单快速：20分钟出结果
• 使用方便：细胞上清与试剂混合，两次读值，计算比值即可
• 应用广泛：可检测所有常规的支原体和无胆甾原体的污染，适用于多种样品类型
• 灵敏度佳：＜50cfu/mL灵敏度，有效避免假阴性结果
• 多种选择：不同规格试剂盒可供选择
• 整体方案：试剂盒中含有实验所需试剂，可以配套Lonza Lucetta™ 2检测仪和化学发光功能酶标仪系统

参考文献：

[1]Chapter <63> Mycoplasma Tests. The United States Pharmacopeia's(USP)

[2]MycoAlert™ mycoplasma detection kit, Mycoplasma detection assay -Instructions for use.©2011Lonza Walkersville, Inc.

[3]MycoAlert Mycoplasma Detection Assays on Molecular Devices MicroplateReaders. Application Note. ©2015 Molecular Devices, LLC

[4]Lonza's MycoAlert assay on a BMG LABTECH plate reader. BMG LABTECHResources|Application notes|AN130

[5]Mycoplasm detection with the MycoAlert™ assay system. ApplicationNote 2007, ©Tecan Trading AG

[6]Biotek: Mycoplasma Detection Using Synergy 2 Multi-Mode MicroplateReader and the Lonza MycoAlert Assay. Application Note. ©2008 BioTekInstruments, Inc.

[7]MycoAlert Mycoplasma Detection Assay (Lonza)on the SpectraMax LMicroplate Luminometer. SpectraMax Application Note #21. ©2010Molecular Devices, Inc.

[8]Detecting Mycoplasma using MycoAlert®on the GloMax®-Multi+ Detection System. Promega