Lonza内毒素检测实用问答看这一篇就够啦

理论与实践

内毒素检测实用问答①

内毒素检测在现代生物制品和医药领域中扮演着至关重要的角色，注射类药物、注射器具，植入医疗器械等都有相应的质量标准，用以确保产品安全性。然而，在进行内毒素检测的过程中，许多实验室和研究人员可能会面临一系列挑战和疑惑。

从选择合适的内毒素检测试剂盒和试剂耗材，到配备必要的仪器设备，每个步骤都需要精心考虑。

Lonza作为内毒素检测领域的专家，今天小编邀请到了技术大佬加菲哥，为大家带来内毒素检测问答系列，本系列文章旨在解答您在内毒素检测中可能遇到的常见问题，提供实用建议，帮助您更好地理解并成功应对内毒素检测过程中的关键问题。

无论您是初次接触内毒素检测还是希望深入了解此领域的专业人士，本系列文章将为您提供龙沙有关内毒素检测方面的独特见解和实用的建议。

文末webinar报名切勿错过

1. 如何选择内毒素检测试剂盒？

检测测方法的选择：如果做范围定性检测，可以使用凝胶法试剂盒（如PYROGENT™）。但如果需要定量检测，凝胶法试剂盒可能就不适合，因为凝胶法检测一般只能给出小于或大于的结果，其通过对样品进行多次稀释，将样品的EU/ml结果缩小到一个范围，一般是当作半定量的方法。

如需要选择定量检测进行内毒素检测比较适合的是浊度法试剂盒（如PYROGENT™-5000），显色法试剂盒（如Kinetic-QCL™）和重组C因子方法试剂盒（如PyroGene™）。

▲ PYROGENT™-5000动态浊度LAL试剂盒

▲ Kinetic-QCL™ 动态显色法LAL试剂盒

另外，在样品放行限度和样品稀释需求进行检测灵敏度考量方面：

· PYROGENT™凝胶法试剂盒灵敏度为0.03、0.06、0.125 和 0.25 EU/mL

· 动态浊度法PYROGENT™-5000试剂盒灵敏度为0.01EU/mL

· 动态显色法Kinetic-QCL™灵敏度为0.005EU/mL

· 重组C因子方法检测灵敏度为0.005EU/mL。

2. 内毒素检测需要哪些仪器设备？

不同内毒素检测方法需要使用不同配置的设备。

使用PYROGENT™ 凝胶法，则需要37°C 恒温加热仪。

使用动态显色法Kinetic-QCL™或动态浊度法试剂盒PYROGENT-5000™，则需要光吸收酶标仪和相应软件。酶标仪还应具有振荡和37°C恒温孵育功能，动态显色法Kinetic-QCL™需要配置405nm光吸收检测通道，PYROGENT-5000™试剂盒需要340nm光吸收检测通道。Lonza Elx808™、Nebula™ MMR、Nebula™ AR均能满足以上性能要求。

▲ Nebula™吸光度酶标仪

使用PyroGene™ 重组C因子试剂盒，则需要380nm（激发波长）/440 nm（发射波长）滤光片组合荧光酶标仪，Lonza PyroWave™ XM、Nebula™ MMR均能满足以上性能要求。

▲ PyroGene™ 重组因子C试剂盒

所有的内毒素检测试剂盒的使用都需要使用涡旋混匀仪和移液器，以及计时器。

此外，推荐搭配内毒素检测专用软件WinKQCL™ ，用于内毒素定量检测。该软件除了具有常规的数据采集、权限管理、审计追踪、数据完整性、数字签名、数据分析、报告生成和导出、LIMS/MES等系统对接功能和数据备份功能外，还有您所期望的趋势分析、数据安全性和“smart stop”（智能停止）功能，以及审计追踪条目筛选、一个板子同时运行多个实验并独立生成报告的功能。

3. 如何查询内毒素检测试剂盒的CoA和SDS文件？

所有内毒素检测产品都可以在Lonza Bioscience | Lonza官网输入试剂盒货号和批号进行CoA查询和SDS下载。

4. 为什么建议使用玻璃器皿不建议使用塑料器皿？

塑料表面比玻璃表面对内毒素的吸附力更强。因此，建议制备内毒素对照标准(CSE)稀释液时使用硼硅酸盐玻璃稀释管。某些情况下，某些塑料器皿也可以用于内毒素检测。

总之，玻璃是首选材料，PE（聚乙烯）次之，PP（聚丙烯）再次之，也有客户反馈还可以使用PET材质器皿。如果需要对样品进行保存，建议对不同材质容器的进行相应验证，保证样品中内毒素在储存后是否可以回收的。

5. 为什么CSE稀释液配置涡旋过程很重要？

内毒素会粘附在玻璃表面上，可以通过适当的涡旋来充分溶解和混匀，以保证反应管或微孔板中的溶液具有准确的EU/ml浓度。如说明书所述，稀释之前，CSE小瓶应剧烈涡旋15分钟，每次使用CSE时都应重复此操作。标准品梯度稀释液配制时，建议至少涡旋一分钟。标准品使用前也建议涡旋CSE稀释液几秒钟以确保均匀度和准确性。

6. 为什么要使用匹配的试剂？

首先，是合规性要求。

其次， Lonza的每个LAL鲎试剂批次都使用美国药典内毒素参考标准品(RSE)EC-6（效价为10000EU/瓶）进行效价测试。然后通过与RSE平行测试，将该LAL鲎试剂批次与我们的工作标准品(CSE)相匹配。该RSE/CSE相关测定确定了该批次CSE与该批次LAL鲎试剂一起使用时的效力，因此需要匹配使用。

FDA表示，使用LAL鲎试剂制造商的质量证书使公司不必自己进行RSE/CSE比较。Lonza提供所有检测方法的试剂盒，并且有匹配的试剂，使内毒素检测更简单。

7. 如何确定工作标准品(CSE)的效价？

Lonza用于测定CSE效价的方法可在每个匹配试剂盒的CoA中找到。

常见方法为：多支CSE稀释后被当作未知样品，通过RSE稀释梯度来进行检测和计算，单位为EU/ml。对于定量检测方法，检测结果在RSE标曲范围内的多支CSE检测值进行平均即可得到效价。

8. 应该如何配制LAL试剂？

请温柔对待Lonza LAL鲎试剂。复溶后通过轻轻倒置或旋转小瓶，瓶内试剂会很容易溶解，涡旋或剧烈摇晃复溶后的LAL试剂会产生气泡。

使用前几分钟重新配制即可，加入LAL鲎试剂后，切勿涡旋。

9. 应该如何准备样品进行测试？

测试前，需要根据样品实际情况进行样本前处理。大多数样品只需要稀释，使用内毒素检测试剂盒进行测试即可。

可以通过样品的MVD（最大有效稀释倍数）确定样品的可稀释倍数。样品MVD=内毒素限值(EU/ml)/λ（λ为标准曲线的最低浓度值，对于凝胶凝块，λ为鲎试剂的标记灵敏度）。样品稀释倍数不能超过MVD，为了保证足够的安全范围，建议稀释倍数尽量不要超过1/2MVD。

如果样品有蛋白酶干扰并导致假阳性结果，建议对样品稀释并70°C加热5-15分钟进行热灭活处理。如需要，可以对灭活样品进行进一步稀释后检测。

如果样品可能含有受β-葡聚糖，建议使用β-葡聚糖阻断剂(b-G-BlockerTM)。β-葡聚糖可能来自酵母和纤维素材料。鲎试剂测试中可以看到β-葡聚糖常见的稀释/反应模式：浓缩样品的阴性响应、稀释度增加时阳性响应，最高稀释度时阴性响应。使用动态检测法，β-葡聚糖污染的样品中经常出现协同增强效应。

如果样品中因含有内毒素结合物而存在抑制，可以尝试使用分散剂PYROSPERSE™。比如脂质乳化剂，电解质溶液，血清和血浆蛋白样品也可以使用PYROSPERSE™。

10. 样品合适的pH值是多少？如何调节pH?

内毒素检测是一系列的酶促反应过程，最适反应pH值范围为6-8，因此样品建议pH为6-8。如果样品pH值超出此范围，可以使用缓冲液如Tris Buffer、HCl或NaOH进行调节。

为确保缓冲液不含内毒素，需要在使用前进行检测，或者选择商业化试剂，如Lonza的50 mM Tris Buffer。

11. 如冰箱的温度超出了预设范围，试剂还可以使用吗？

这个问题经常被问到，请尽量进行冰箱温度监测，保证温度正常。

内毒素检测试剂产品的正常储存温度为2-8°C。如果试剂没有复溶的情况下，短时间内的失温对试剂影响不大，冻干组分很稳定。如果遇到该情况，建议对试剂盒进行初始质量测试，以确认该试剂盒性能状态。

最后，为了进一步深入探讨内毒素检测的理论与实践，Lonza将在12月19日晚7点带来年底巨献直播，本次我们邀请到了业内知名的内毒素检测专家王晓明老师，及Lonza技术专家王红女士，与大家深度分享关于细菌内毒素检测的内容。

无论您是希望深入了解内毒素检测的理论知识，还是渴望掌握更多实际操作技巧，这场直播都将为您带来丰富的内容和精彩的见解。现在就立刻扫码报名吧！

讲师介绍

王晓明

QD瓦格纳生物 首席顾问

在纽约瓦格纳学院获得微生物学硕士学位，先后在美国SGS、强生和礼来公司从事微生物质量控制。2015年，被礼来公司总部派到礼来苏州制药有限公司负责无菌保障。2018年6月至2022年6月，任信达生物制药公司QC微生物执行总监及MST无菌保障专家。曾任美国PDA(注射药协会)的Treasure，工业微生物协会新泽西分会副会长，纽约瓦格纳学院微生物系兼职教授。著有《制药工业微生物控制及无菌保障》《细菌内毒素》。

王红

Lonza 技术专家

在Lonza负责内毒素质控相关产品的应用。毕业于中国药科大学生命科学与技术学院，曾在礼来负责质控相关工作。加入Lonza前，在制药行业拥有多年内毒素检测经验。