Simoa测定表征和验证方法——检测极限和定量下限（Part 1）

介绍

这篇博客文章的目的是为Simoa®用户提供有效的资源，用于检测下限（LOD）和定量下限（LLOQ）的常见分析验证。确定检测和定量下限的方法在复杂性上有所不同，这取决于测定开发阶段和适用的法规。例如，在早期开发中，通过简单地插值校准曲线来近似LOD可能就足够了，但对于最终验证，可能需要使用真实样本进行更深入的实验和统计方法。

指导方针

临床和实验室标准研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI）专门为诊断免疫测定验证提供了一些最具参考价值的指南。这些指南发表在一系列文件中，如CLSI EP17——临床实验室测量程序检测能力评估，第2版。除了CLSI指南外，欧洲药品管理局在其ICH Q2（R2）分析程序验证——科学指南文件中提供了另一套有价值的指南，用于验证各种分析方法，不限于免疫测定。本指南主要侧重于药品质量控制中使用的分析方法。

检测极限和定量极限的估计

CLSI指南使用三种检测质量属性来接近检测能力：空白限度（Limit of Blank LOB）、检测限度（Limit of Detection LOD）和定量限度（ Limit of Quantitation LOQ）。

LOB：当对不含分析物的样品进行重复测试时，预计会发现的最高表观分析物浓度。

LOD：可与LOB可靠区分的最低分析物浓度，在该浓度下检测是可行的。

LOQ：分析物不仅可以可靠检测，而且可以达到某些预定义目标（即精度和偏差）的最低浓度。

高灵敏度测定的特征在于低LOD；然而，低LOB也是实现低LOD所必需的。在任何免疫测定中，由于非特异性结合（例如，检测抗体与捕获表面和/或抗体之间的弱相互作用），都会有固有的背景信号，但可以采取步骤将其最小化。在Simoa®开发Homebrew时，我们通常建议将空白信号的目标定为每珠平均酶数0.005–0.05（AEB）。然而，了解空白样品和低浓度样品的可变性是评估测定检测能力的关键。根据CLSI EP17指南，含有LOD分析物的样品应在95%的时间内与LOB区分开来。

设计实验以评估检测限时要考虑的变量包括要测试的试剂盒批次数量、操作员数量（如果使用手动步骤的仪器，如SR-X）、天数（分析批间变异性）、要测试的不同空白样品/低浓度样品数量，以及要测试的空白/低浓度样本的总重复次数。根据定义，LLOQ必须等于或大于LOD。LLOQ的确定与LOD的不同之处在于，还需要满足精度和偏差的预定义目标。通常，精密度的目标是将产生20%或更低的浓度变异系数（CV）的最低分析物浓度。可以使用各种方法来确定LLOQ，Quanterix使用的三种方法在客户门户网站上的技术说明中有描述（TECH-0034；定量下限）。4PL方法开发工具（也在客户门户网站上）使用一种称为CV分析的方法，根据校准曲线数据估计LLOQ。电子表格不是为用户设计的验证工具（因此计算是隐藏/锁定的），但它可以是早期分析开发中的有用工具，也可以用来表征正在开发或测试的分析的性能。