使用Revvity VICTOR Nivo进行细胞水平的HTRF检测

在药物研发过程中常用细胞学分析，来揭示化合物在体外诱导的效应。本文中，我们将介绍使用VICTOR Nivo进行细胞水平的HTRF检测，分析α-微管蛋白乙酰化-K40水平。在人类神经系统疾病中，常发生微管蛋白乙酰化，因而被广泛研究。αβ-微管蛋白异二聚体形成微管，微管是细胞骨架中的基本聚合物。通过翻译后修饰（PTMs），细胞调节微管结构和功能。α-微管蛋白在K40上的乙酰化在其他PTMs中起关键作用。

已知抑制HDAC6（组蛋白去乙酰化酶6）后，会使微管蛋白乙酰化上调，我们采用了小鼠成纤维细胞（NIH-3T3细胞），在VICTOR Nivo上进行了两个HTRF实验：首先，评估了分析所用的最佳细胞接种数量；其次，研究了化合物 Trichostatin A和Tubacin对α-微管蛋白K40乙酰化的影响。

实验方法及结果

1细胞数量优化

将预先收获的NIH-3T3细胞用标准培养基稀释成50,000至3,125个细胞/孔密度，100μl/孔转移至96-孔 CulturPlate (#6005680)，置于培养箱中培养2天。随后，依照操作手册，用HTRF试剂盒中自带的细胞裂解液裂解30分钟，取16μl/孔细胞裂解上清液，转移至384-孔 OptiPlate(#6007290)。然后分别加入Anti-alpha-Tubulin acetyl-K40-Tb3+ Cryptate和Anti-alpha-Tubulin acetyl-K40-d2抗体各2μl，室温孵育2小时。并设定三组对照作为质控：

阳性对照：

control lysate + Anti-alpha-Tubulin acetyl-K40-d2 + Anti alpha-Tubulin acetyl-K40-Tb3+ Cryptate

阴性对照：

lysis buffer + Anti-alpha-Tubulin acetyl- K40-d2 + Anti alpha-Tubulin acetyl-K40-Tb3+ Cryptate

空白对照：

cell lysate + detection buffer + Anti alpha- Tubulin acetyl-K40-Tb3+ Cryptate

孵育结束后，在VICTOR Nivo上检测HTRF信号。结果显示，阳性对照（control lysate）与阴性对照窗口大于2，符合实验指南；与阴性对照比值大于4。测试了５个NIH-3T3细胞接种密度，HTRF比值呈现密度依赖关系，选择接种密度12,500个细胞/孔用于后续实验。

2化合物检测

据报道，化合物Trichostatin A和Tubacin抑制HDAC6，从而增加细胞微管蛋白乙酰化。在96孔板中，接种NIH-3T3细胞12,500个/孔，培养1天后，加入待测化合物50 μl/孔。用另一96孔板制备化合物，以培养基稀释12个化合物浓度（DMSO终浓度为0.5%）。Trichostatin A检测浓度范围为1.4x10-11–2.5x10-6M，Tubacin浓度范围为1.4x10-9–2.5x10-4M。同时设置DMSO对照和未处理细胞对照。给药18小时后，同上述方法检测。两种化合物均呈现剂量-效应关系，EC50 (Trichostatin A)=40.5±0.2nM 及EC50 (Tubacin)=4.95±0.84uM，与文献报道所述数量级相符。

总结

VICTOR Nivo是一款体积小、功能强大的桌面多功能酶标仪，配备了所有主要检测技术：光吸收、化学发光、荧光强度、荧光偏振、AlphaScreen和时间分辨荧光（包括HTRF、LANCE和DELFIA）。通过本实验，我们发现基于细胞的α-微管蛋白乙酰-K40 HTRF分析试剂盒易于操作，非常适合在VICTOR Nivo上进行HTRF模式检测。在一系列实验中，VICTOR Nivo操作简单智能，用户可按照protocol推荐的检测参数，无需进一步调整，即可读板。总之，HTRF认证的VICTOR Nivo适用并支持HTRF试剂盒检测应用。

参考文献

Using the VICTOR Nivo for Cell-Based HTRF Assays | PerkinElmer