首个TIL疗法获批 | 看IsoPlexis单细胞功能蛋白组如何助力TIL功能评估

今年2月16日，Iovance Biotherapeutics公司宣布FDA加速批准其肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）疗法AMTAGVI（lifileucel）上市，用于治疗先前经过PD-1抗体治疗的不可切除或转移性黑色素瘤成年患者。据悉，lifileucel是全球首款获批上市的TIL细胞疗法，标志着细胞疗法在肿瘤治疗领域的又一重要里程碑。

开发有效的TIL疗法需要对TIL细胞本身的功能特性的深入理解，更取决于如何开发能够快速扩增且保持TIL细胞功能的生产工艺。在TIL回输到患者体内，治疗作用的持久性如何保持，也需要对T细胞的动力学有更深入的了解。IsoSpark/IsoLight单细胞功能蛋白质组学表征平台自上市以来，在细胞治疗领域被应用于不同的研发阶段。在TIL疗法领域，关于TIL的功能研究、生产工艺评估和回输后的免疫监控上都已经有应用案例。其中近期备受关注的Iovance在其生产工艺的优化中也使用到IsoCode单细胞适应性免疫芯片，用于评估TIL细胞的多功能性。我们今天再重温一下几个经典案例。

案例1：TIL生产工艺开发过程中T细胞功能评估

研究目的

Iovance开发第二代生产工艺（Generation-2）扩增的TIL，是否让TIL细胞群体重新激活，相对于内源性TIL（D0），经过22天的培养扩增后得到的细胞产品功能评估。

实验设计

从消化的肿瘤活检中分离的内源性CD3+ TIL（D0）进行分选，并与使用 Iovance的Gen 2工艺扩增22天后（D22）的TIL进行比较（图1）。来自黑色素瘤、宫颈癌和头颈部鳞状细胞癌的7对D0和D22 TIL的T细胞亚群，利用TCR复合物激活后上样到IsoCode单细胞适应性免疫芯片上，评估比较D0和D22两个时间点CD4+和CD8+ T细胞的多功能性。

图1. 实验流程图和IsoCode单细胞分泌蛋白组芯片靶标

实验结果

当TIL细胞刚刚从肿瘤组织中分离出来时，几乎没有多功能细胞。经过Iovance第二代TIL扩增培养22天后，TIL中CD8+和CD4+的多功能性细胞比例和PSI（细胞多功能强度指数）显著升高，共计八种细胞因子被检测到。说明Iovance的第二代（Gen2）TIL扩增方案从多功能细胞角度能够让T细胞有效激活。

结论

IsoCode单细胞分泌蛋白组芯片提供对于TIL细胞治疗产品工艺变更后对工艺进行评估。

图2. IsoCode单细胞分泌蛋白组芯片分析肿瘤中分离出的TIL（D0）和扩增后TIL（D22）功能。

案例2: 多组学表征肿瘤中CD8+T细胞

研究目的

对多个患者队列和六大类肿瘤类型的CD8+ T细胞特征进行多组学分析。通过生成的scRNA-seq 和 scTCR-seq 数据以及使用荟萃数据集进行概念验证分析。这些概念在功能上用原始患者样本进行了功能等多方面的验证。这使研究者能够精确地定义富集CD8 + TEX的人类肿瘤与其他类型的功能低下CD8 + T细胞的不同特征。

实验设计

单细胞功能蛋白组学平台用于评估胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤组织内CD8+ T细胞的功能。从GBM切除的肿瘤样本中新鲜分离出患者来源的CD8+ T细胞与健康人PBMC来源CD8+T细胞比较，评估其在anti-CD3/CD28刺激下或无刺激下的功能变化（图3A）。

图3. 功能性单细胞分泌组分析揭示GBM来源的CD8+ T细胞的耐受样表型。

实验结果

聚类结果显示，尽管刺激条件相同，PBMC和GBM来源的肿瘤CD8+T细胞显示出不同聚类（图3B）。与PBMC相比，激活后的GBM CD8+T细胞的多功能性非常低，变化幅度也明显更低（图3C, D）。GBM来源T细胞的PSI不是由效应细胞因子 (IFN-γ) 或炎症细胞因子 (TNF) 的分泌驱动，而是由促骨髓趋化因子如IL-8、CCL3和CCL4（它们在伤口愈合过程中具有冗余功能）驱动（图3E）。这些数据表明大多数GBM-CD8+ T细胞功能低下的表型可能会增强促骨髓细胞的功能。

结论

单细胞分泌蛋白组能够帮助研究者探索不同肿瘤内T细胞的功能状态，从而更好地理解肿瘤免疫功能，并为后续的免疫治疗方式提供深入见解。

其他相关阅读：布鲁克单细胞功能表征双平台：揭示头颈鳞癌中肿瘤特异性T细胞功能特征

案例 3: TIL治疗PD-1耐药转移性肺癌患者一期临床研究

研究目的

此研究位针对PD-1后期耐药患者加入TIL联合疗法治疗的Phase I临床试验。所有患者均接受至少四个周期的 PD-1免疫检测点治疗，对PD-1产生耐药并发生肿瘤进展的患者实施TIL治疗。主要终点是安全性，次要终点包括客观缓解率、缓解持续时间和T细胞持久性，并进行探索性地T细胞分析。

实验设计

在针对T细胞的持久性和表型的研究中，研究者采集12位患者TIL输注前、输注当天和输注后第4周和第12周PBMC，分选出CD4+和CD8+ T细胞，利用anti-CD3/CD28抗体刺激后进行单细胞功能性评估。

实验结果

如图4数据比较显示了12名患者输注TIL前后，CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的PSI (Polyfunctional Strength Index，多功能强度指数)，反映了细胞同时表达多种细胞因子及其表达量，再综合分析因子数及表达量来评估细胞的多功能活性。可以明显看到CD4+ T细胞和CD8+ T的多功能细胞数量和PSI细胞多功能指数在TIL输注后显著增加，进一步证实TIL疗法提高T细胞的功能性，对转移性NSCLC的有效性。

图4. TIL回输前后外周T细胞功能变化

"We assessed the polyfunctional strength index (PSI), which is an indicator of the number of cells capable of secreting multiple types of cytokines. Since PSI reflects the ability of a T cell to carry out multiple functions, it is recognized as a metric for the potency of cell therapy, and for the efficacy of vaccines. "

综上，IsoSpark单细胞功能蛋白质组学平台能够帮助研发者：

• ✓深入理解不同肿瘤TIL的功能特征
• ✓评估TIL生产工艺对TIL细胞功能的影响，以促进更好的工艺的开发
• ✓回输后的免疫细胞功能监测，深入理解TIL的作用动力学和人外周T细胞功能动态变化

参考文献：

1.Michelle R. Simpson-Abelson,et al. ESMO VIRTUAL CONGRESS 2020,1053P.

2.Naulaerts, Stefan, et al. Science Translational Medicine 15.691 (2023): eadd1016.

3.Creelan, Benjamin C., et al. Nature medicine 27.8 (2021): 1410-1418.