成为转染高手，一定要知道这 4 个方法，搞清楚这 5 个问题

一，转染攻略 — 4 种转染方法比较

细胞转染是指将外源分子如 DNA、RNA、蛋白质等导入到真核细胞的技术。随着基因和蛋白功能的深入研究，转染已经成为科研实验中最常用的技术手段之一。

细胞转染技术主要分为三大类：物理转染法、化学转染法及生物转染法

理想的细胞转染方法应具有转染效率高、细胞毒性小及重现性好等特点。目前常用的转染方法有阳离子聚合物转染、脂质体转染、电穿孔和病毒感染，不同的转染方法各有利弊，没有一种转染试剂是普遍适用的，我们需要依据自己的实验需求选择合适的转染技术及转染试剂，才有可能得到理想的实验结果。

二，转染攻略 — 5 个问题全面解答

1. 细胞状态

细胞状态不好，会导致转染效率低下，为确保良好的细胞状态需注意以下几点：

a. 转染实验前，细胞解冻后传代 3～4 次；

b. 使用活性 > 90% 的细胞,可通过台盼蓝染色等测定细胞活性；

c. 定期传代细胞，切勿让细胞长到汇合状态或过度生长，多数情况下，当细胞汇合度达到 60%～80% 时转染效率较高。

2.使用优质 DNA

为实现高效率、低毒性的转染，应使用高质量的 DNA（高纯度、无菌、无内毒素）。

a. 使用无内毒素的试剂盒和实验方案制备 DNA；

b. 测定 DNA 纯度，OD 260/280 值应介于 1.7～1.9 之间，越接近 1.8 越好；

c. 使用无 DNA/RNA 酶的水或 TE 稀释 DNA。

3.载体构建

若质粒基因产物对细胞有毒害作用，则转染难以成功。转染载体的构建选择可调控，强度合适的启动子很重要，可以以空载体或相同载体的其他基因为对照排除毒性对细胞的影响。

4.优化转染试剂/DNA 的比例

不同细胞系转染效率通常不同，需要进行预实验，选择合适浓度的 DNA，调整 DNA 与转染试剂的比例，以获得较高的转染效率。

5.防止污染

细胞污染也会造成转染效率低下，为防止细胞污染应注意：

a. 培养物污染

培养物可被细菌、真菌、病毒、支原体或其他细胞种类所污染，各种污染均会导致结果错误。

b. 支原体污染

支原体污染一般难以察觉，培养的细胞被支原体污染后，几乎可以改变细胞的所有功能，包括酶的作用途径，细胞膜的组成，染色体结构，以及转染效率。因此，必需进行支原体污染的常规筛查。

c. 交叉污染

三，转染攻略 — 2 个方法助力效率验证

转染完成后需要对转染效率进行验证，常用的转染效率验证方法有以下两种：

1、利用含 GFP 或 RFP 之类报告基因的质粒作为阳性对照，评估转染效率。

使用荧光显微镜或流式细胞仪可以测定转染细胞和 GFP 蛋白表达细胞的百分比。

a. 转染后 24～48 小时，即可以检测到质粒的表达。

b. 阳性对照可以放在一个单独的孔中，或是与目的质粒共转染。

2、利用 qPCR 法精确定量目的基因。