微流控蛋白电泳 LabChip GXII Touch——快速且高通量的蛋白解决方案

抗体药物的研发和生产过程非常复杂，有诸多技术瓶颈，如全人源抗体筛选核心技术平台的建立和制备、高表达细胞系的构建、细胞培养与蛋白纯化工艺步骤及过程对产品纯度和各项理化特性的影响等。因此，无论是FDA提出的质量源于设计（QbD）原则，还是我国的《生物类似药研发与评价技术指导原则》，都对生物大分子药物的工艺开发提出了更高的要求。现在QbD理念已经普遍被国内外药物研发企业认可和推崇，它强调需要确定并理解影响蛋白药物疗效的关键质量属性（CQA）。严格地监督和控制这些属性，有助于确保稳定的、更加可预测的研发和工艺流程。

针对生物大分子药物研发和生产过程的筛选与质控，基于微流控技术的LabChip® GXII Touch能够对细胞培养液上清及纯化后的抗体、融合蛋白的滴度、纯度、糖基化程度、片段化及聚合、糖谱、电荷异质性等关键质量属性进行快速、准确、可重复、自动化的定性定量分析，以及克隆构建过程中的DNA、RNA分析。每个样品的分析时间耗时少至42秒，提供可以媲美传统毛细管电泳的数据同时，通量增加70倍。

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纯度检测

目前，监测蛋白质产品质量的方法包括SDS-PAGE、毛细管电泳（CE）和HPLC。SDS-PAGE劳动强度大，且难以实现自动化，在现代分析实验室中已被基于CE的分析方法代替。CE和HPLC分析需要15-60分钟/样品分离时间，一定程度上限制了DOE研究。在过去的十几年中，基于微流控的检测方法广泛应用于蛋白质的大小测定、定量和纯度评估，因为它有效解决了SDS-PAGE、HPLC和CE方法的局限性。

图1：Micochip与传统CE-SDS方法的比较。还原单抗样品同时利用 (A) LabChip® 90和 (B) Proteomelab PA800进行分析

美国Amgen公司分析与制剂科学部门2008年在Electrophoresis杂志上发表的文章中[1]，对使用LabChip技术筛选mAb产品质量属性进行了研究。他们在还原和非还原条件下分析了来自CHO细胞培养上清粗提液的mAb和纯化产物，所得分辨率和灵敏度与传统CE-SDS相似，但分析速率要快大约70倍（42秒 vs 50分钟/样品，如图1）。Amgen研发人员在该文章中使用HT Protein Express assay对粗提样品中的非糖基化重链（NGHC）进行定量分析，以测定高甘露糖的相对含量。他们最终得出结论，该实验可为早期细胞培养筛选提供有价值的反馈。

微流控毛细管电泳方法用于单抗药物生产质控和放行分析

美国GSK公司生物制药分析科学部门2017年在Electrophoresis杂志上发表的文章中指出[2]，他们已经成功将微流控毛细管电泳检测方法贯穿应用在整个单克隆抗体产品开发和生产质控流程中，包括前期研发以及后期cGMP（现行药品生产管理规范）放行和稳定性测试。整个实验测试是在LabChip® GXII Touch系统上采用HT Protein Express assay检测完成。

LabChip® GXII Touch系统检测mAb样本的还原以及非还原结果均符合DOE系统适应性以及样本验收标准，典型图谱如图2a和2b所示。

图2a.还原样品电泳图-mAB1 图2b.非还原样品电泳图-mAB1

高分辨率蛋白纯度分析——进一步满足生产质控的高要求

基于LabChip® GXII Touch微流控平台的Protein Clear HR assay是专为mAb研发和生产过程中的高分辨率蛋白纯度分析而设计开发的，能够可视化地检测样品中低至5ng/μL的杂质。它在Protein Express assay的基础上，更加提升性能，使得样本纯度分析的重复性更上一层楼，可以进一步满足生产质控的高要求。利用LabChip® GXII Touch系统的分析能力和速度，以及IntelliChip的实验参数自动反馈优化技术，您可以拥有无以伦比的通量和重现性，从而加速蛋白研发流程。

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糖谱分析

糖基化等转录后修饰对于蛋白质功能有很重要的作用，它会影响治疗性抗体的药代动力学、药效以及安全性等。抗体生产过程中培养基、pH值、温度等条件的变化都会影响糖基化的结构。因此，各家药物生产商必须在研发和生产中不断对糖型进行检测分析。如果用传统的HPLC，CE-LIF技术或者质谱技术来分析N-糖型，通常需要2-3天的时间来进行消化、标记和分析，而利用一体式的标准Profiler Pro Glycan试剂盒，在LabChip® GXII Touch上实现高分辨率的分离检测，96个样品可以在不到6个小时之内完成。每个样品检测可在45秒内完成，且只需要8μL样品。同时LabChip芯片和试剂盒适用于多次检测，单次芯片制备最多可运行192个样品。

图3. 糖谱分析图

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电荷异质性分析

LabChip® GXII Touch技术可用于鉴定相对于mAb主峰的碱性和酸性变体，其结果生成速度比常规IEX（离子交换色谱）和CZE（毛细管区带电泳）快15倍，且能够自动计算变体的相对百分比。更大的通量意味着您可优化使用宝贵的研究时间，使药物更快进入到临床。

图4. LabChip® GXII Touch荷电异质实验（左图）与传统CZE实验（右图）的比较。碱性区的迁移快于主峰，而酸性区迁移则较慢。用户可使用系统软件工具“Expected Peak”命名各样品峰，各变体的相对百分含量自动以表格形式显示。

LabChip® GXII Touch系统能快速分析蛋白样品的纯度、滴度、糖基化程度、糖谱分析、电荷异质性等多项关键质量属性，为生物治疗药物研发和生产流程的各个环节提供快速分析和样品质控。同时也该系统可以对DNA、RNA、Small RNA等核酸样品进行片段分析及质控。

除了微流控平台外，我们还可以利用多模式平台，结合灵活、灵敏的HTRF和ALPHA等技术，针对抗体生产的原材料制备、转染和抗体生产等多个环节提供高通量的质控解决方案。例如，靶向抗体的稳定性和聚集性检测，我们一方面可以通过直接检测抗体的自发荧光变化，研究尿素诱发的抗体变性过程[3]，我们也可以利用ALPHA技术，配合抗热的、特异识别构象表位的纳米抗体开展抗体/蛋白复合物的热稳定性研究[4]。针对CHO等工具细胞株的一些重要污染指标，如dsRNA和HCP残留等，我们则提供商业化的成熟解决方案[5，6]。

左图：该案例利用Envision多模式检测平台，开展尿素诱发的抗体变性研究。通过检测抗体自发荧光（280 nm ex/340 nm em）的变化，研究证明突变后抗体m01s5.4，在尿素压力下的稳定性要弱于m01s[3]. 右图：基于AlphaLISA，研究使用EnVision多模式检测平台结合384-well OptiPlate孔板检测疾病相关突变对γ-分泌酶稳定性的影响[4]。