如何做好生物发光小动物活体成像实验？

萤火虫荧光素酶的发射波长560nm,在体内会红移至610nm,组织穿透性更好，适用于动物内脏等较深部位的组织成像。优点包括底物不产生本底光源，底物干净，对照组的设置就相对容易。但缺点也有，相对分子质量较大，在62-64kDa，不适宜转一些小细胞或细菌，影响表达效果；同时，需要镁离子及ATP的参与才能发生酶促反应产生发光现象，一些能量代谢，对镁离子或ATP特别灵敏的实验，要注意检测手段对结果波动的影响。但普通的肿瘤或干细胞检测，则不影响检测效果。

海肾荧光素酶的发射波长480nm，此波段小鼠的皮肤、毛发、血液、脏器对光的吸收较强，因此其产生的蓝光组织穿透能力较弱，适用于动物浅表组织成像；优点是相对分子质量较小，可用于一些小的细胞及细菌，发光过程不消耗ATP及镁离子。但缺点是底物会有一定的本底光源，底物打入小鼠后，也会有微弱的信号，此时对照组的设置要求相对就严格一些。

根据实验目的，合理设计我们的实验方案，选取合适的荧光素酶，建立稳定的细胞系及转基因动物后，注射适当的生物发光底物即可进行活体成像设备的拍摄研究。

常用的底物给药方式有腹腔注射和尾静脉注射

腹腔注射：迅速分布全身，并穿过包括大脑在内的血液组织屏障；注射底物后10～20 分钟进入成像平台期，发光信号达到峰值并逐渐减少；2h后信号消失，不可检测。

尾静脉注射：可提供更高的发光强度，5～10倍的高信号，但是注射难度较高，代谢快。底物注射后约2min进入信号峰值，约30min后信号消失。

建议：第一次使用荧光素酶底物成像，或者更换新品牌底物，需要进行预实验，观察底物在何时达到峰值。确定注射荧光素底物和成像之间的最佳延迟，然后将此时间用于所有实验，以标准化成像数据。生物发光信号的动力学具有组织依赖性。建议每5-10min对动物进行一次成像，最多40min，为每个新建模型创建一个发光动力学曲线。常见信号峰值时间点在10-15min左右，荧光反应发光一般在30min后衰减，3h后完全消失。

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