GPCR药物筛选四大核心技术：从初筛到功能验证的全流程方法学比较

在创新药物研发领域，G蛋白偶联受体（GPCR）作为最重要的药物靶点家族之一，始终占据着举足轻重的地位。据统计，目前市场上约34%的药物都针对GPCR这一靶点家族—从降压药到抗过敏药，从精神类药物到代谢疾病治疗，GPCR靶向药物几乎遍布临床治疗的各个领域。

面对如此重要的靶点家族，如何选择合适的筛选方法成为研发成功的关键。目前，针对GPCR的药物筛选，科研人员常用的主流方法包括均相检测技术（如HTRF、AlphaLISA）、报告基因检测、钙流检测和放射性配体结合实验。这四种技术路径各具特色，分别适用于不同的研发场景。本文将详细解析如何在不同的研发阶段做出最优选择。

快速选择指南

追求全流程解决方案与高通量？ → 选均相检测

需要看活细胞信号通路活性？ → 选报告基因检测

专注Gq偶联受体？ → 选钙流检测

精确测量结合力？ → 选放射性配体结合

均相检测技术（HTRF & AlphaLISA）

01技术原理

HTRF/LANCE：基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）技术。当样品中含有待检物质时，供体荧光基团和受体荧光基团通过待检物质在空间上靠近，供体的激发能传递给受体，产生特征发射信号;

AlphaLISA：基于单线态氧能量传递机制。当样品中含有待检物质时，供体和受体距离拉近，供体微珠受激发产生单线态氧，扩散至邻近的受体微珠后触发级联化学反应，产生放大的化学发光信号。

图一. 均相检测原理图

在GPCR药物筛选中，均相检测技术以其独特的优势显著提升了研发效率。作为该领域的代表性技术，Revvity的HTRF和Alpha技术提供了覆盖GPCR信号检测的完整解决方案。（解锁大脑 “信号开关”：GPCR 靶向神经药物研发与瑞孚迪 HTRF/Alpha 均相检测的高敏精准应用）

02优势

操作简便：采用"加样-孵育-读取"的均相检测模式，无需洗涤步骤，显著减少操作误差。

高通量：完美适配384/1536孔板，可满足高通量筛选需求。

兼容性广：轻松应用于各类细胞（包括原代细胞、难转染细胞）。

数据质量优：CV值低，重复性好，适合自动化筛选

节约样本：仅需少量细胞裂解液（10–16 μL）。

图二. GPCR均相检测完整解决方案

03劣势

对某些具有自发荧光的化合物敏感

报告基因检测

01技术原理

通过构建报告基因载体，将GPCR下游信号通路与报告基因（如荧光素酶）表达相偶联。以cAMP反应元件（CRE）驱动的荧光素酶报告系统为例，当GPCR激活后，通过cAMP-PKA-CREB信号通路，最终诱导荧光素酶基因表达。通过检测荧光素酶活性，间接反映GPCR的激活程度。

图三. 报告基因检测原理

02优势

信号放大效应：检测灵敏度高，适合弱效化合物筛选

通路特异性：可设计特定反应元件的报告系统

灵活性高：可定制多种信号通路的报告系统

03劣势

信号间接性：检测的是基因转录激活的最终结果，是信号通路下游的间接事件。

通路覆盖单一：通常只针对某一特定通路（如cAMP反应元件-CRE），无法检测到GPCR通过其他通路（如β-arrestin招募、钙离子动员）产生的效应，从而导致漏检或数据不全面。

检测速度慢，通量有限：需等待基因转录、翻译和积累（通常6-24小时），实验周期较长。

适用性受限：需进行基因改造，难以应用于难转染或分裂缓慢的细胞（如原代细胞、神经元等）。

人为系统偏差：依赖于人工构建的报告质粒和细胞株，改变了细胞自然的信号动力学，导致信号延迟或放大。同时，外源启动子的引入也可能受到细胞内未知因素的干扰。

钙流检测

01技术原理

针对Gq蛋白偶联的GPCR，使用钙敏感荧光染料实时监测细胞内钙离子浓度变化。当GPCR激活后，通过Gq-PLC-IP3信号通路诱导内质网钙释放，染料与钙离子结合后荧光强度显著增强，通过荧光检测设备实时记录信号动态变化。

图四. 钙流检测原理

02优势

实时动力学：毫秒级时间分辨率，完整记录信号动态

超高灵敏度：可检测单个细胞的钙瞬变

技术成熟：方法稳定可靠，结果直观

03劣势

适用范围窄：仅适用于Gq偶联受体。

通量相对较低：信号转瞬即逝，需要快速注入激动剂并读取，难以在超高通量（如uHTS）层面上高效运行。

信号瞬时：检测时间窗口要求严格，难以检测缓效化合物。

染料负载：需精细优化染料加载条件。

信号干扰：检测的是细胞内最基础的生理事件——钙离子动员，细胞内钙离子的升高并非Gq通路所独有。

放射性配体结合实验

01技术原理

基于竞争性结合原理，使用放射性标记的已知配体（如³H-标记的拮抗剂）与GPCR结合。加入待测化合物后，通过测量放射性配体被竞争替代的程度，计算待测化合物与受体的亲和力（Ki值）。采用液闪计数法检测放射性信号。

图五. 放射性配体结合实验原理

02优势

金标准：直接、定量测定结合亲和力

全面性：可检测所有类型配体（激动剂、拮抗剂、反向激动剂）

高灵敏度：可检测低亲和力结合

03劣势

无功能信息：无法区分化合物功能特性

放射性危害：需要特殊防护和废物处理

低通量：操作繁琐，不适合大规模筛选

监管严格：需要放射性实验资质

方法对比总结

结语与建议

在GPCR药物研发中，检测技术的选择需要综合考虑研发阶段、靶点特性、通量需求和资源条件。随着精准药物研发需求的提升，多层次技术联用已成为行业趋势，通过这种阶梯式、多层次的筛选策略，既能保证筛选效率，又能确保数据质量，为GPCR靶向药物的成功开发提供坚实的技术保障。

产品列表（部分）

耗材推荐

消化液推荐-TryPLUS细胞消化液

✅ 即开即用：可在4℃或室温条件下保存，无需解冻等待，显著提升实验效率。

✅ 稳定性卓越：经过改造，无自切风险，且无需抑制剂终止反应，简化操作步骤，降低成本。

✅ 减少细胞损伤：有效保护细胞表面蛋白，提高消化后的细胞活率、贴壁效率及功能完整性。

✅ 性能经过验证：已在上百种细胞系上进行测试，效果与进口品牌相当，目前已有数百家科研机构及药企稳定使用。

✅ 价格亲民：国产化生产，定价仅为进口同类产品的二分之一，性价比极高。

细胞株推荐

采用基因工程手段，将特定GPCR靶点蛋白及其下游关键信号基因整合表达于工程细胞中，精准模拟基于钙流、cAMP、β-Arrestin等通路的信号转导过程。目前，我们已成功开发并储备一百余株GPCR稳定细胞模型，覆盖多个热门药物靶点，且所有模型均已完成HTRF、报告基因等方法学验证，确保其适用于高通量药物筛选与功能研究。