Lonza直播回顾 |不同内毒素检测方法在典型非肠道药物中的测定比较

内毒素是包在革兰氏阴性细菌外膜中的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）。它们代表了制药和医疗设备企业而言重要的热原。内毒素之所以重要，是因为它们在环境中无处不在，热稳定好且不可以过滤去除。重要的是，它们易热解。

在医学上，鲎的珍贵蓝色血液价值大鲎的血液含有一种特殊的免疫细胞——“阿米巴样细胞”。这种细胞对细菌非常敏感，遇到含有使人发热、休克甚至死亡的细菌类毒素会立即凝固或者变色，科学家们根据这种特性研究制造出了鲎试剂，使其成为了世界医疗卫生领域检测细菌内毒素的标准方法，并逐步被收载于药典。根据鲎血来源不同，一般分为LAL（美洲鲎试剂）/TAL（东方鲎鲎试剂）。

由于受国家政策影响，内毒素检测试剂所用原料鲎（中国鲎及圆尾鲎）被列为国家二级保护动物，意味着内毒素检测试剂原料将受到严格管控。随着鲎资源的逐渐减少和重组技术的发展，新一代重组C因子内毒素检测法重磅登场。

与经典的鲎试剂内毒素检查方法相比，重组C因子内毒素检测法具有更高的特异性，更好的专属性、精密度、准确度、线性范围及定量限，是目前鲎试剂内毒素检测方法的改良方法。

目前，重组C因子已得到各国法规的认可，各国药典相继引入重组C因子。其中欧洲药典明确表明重组C因子可用于内毒素检测，并正式写入2.6.32章节，美国和日本药典均已将重组C因子引入至对应指导原则章节。中国药典2020版也在“<9251>细菌内毒素检查法指导原则”中正式体现。

近期，Lonza应美国药典 (USP)的请求研发了一组数据集，用于美国药典正式纳入重组C因子内毒素检测法的数据需求。

Lonza全球专家Allen L. Burgenson 为我们带来一场主题为“不同内毒素检测方法在四种典型非肠道药物中的测定比较”的线上直播课程，助力中国医药产业人才成长。

课程精彩回顾：

https://mp.weixin.qq.com/s/ZAxCBkeBO_D0nONreVt1vQ

Allen L. Burgenson的讲座内容主要包括：

➤ 是否可以使用 LAL 和重组方法检测到原生细菌内毒素？

➤ carbon bed处理后的水样品中是否存在葡聚糖？

➤ 是否可以用LAL 和重组方法测量终产品中的内毒素？

➤ 浊度法、显色法、重组rFC法之间是否存在差异？

Allen L. Burgenson演讲的主题为《比较四种内毒素检测试剂对四种有代表性性的非肠道药物中本土内毒素水平的检测》。讲座的数据是根据美国药典USP<1085.1>细菌内毒素检查法中的重组实际的使用，旨在满足将重组因子C实验列入药典的要求。

方案中包含EDQM用四种内毒素检测试剂（动态浊度法试剂，动态显色法试剂，重组C因子试剂I，重组C因子试剂II）拟研究的四种产品（阿昔洛韦IV，庆大霉素IV，胰岛素，生理盐水IV）。

首先采集Walkersville WFI生产系统的活性炭床处理后水样，在Walkersville检测水样的内毒素污染水平，冷冻样品用于长时间的储存和运输，后在合同实验室对样品的内毒素水平进行检测。

检测方案中，也对碳床处理后水样中葡聚糖的含量进行了测定。出的结果是：碳床处理后水样中无可检出的β-葡聚糖。

根据三次分析的算术平均值，制备稀释液，用于不同产品的加标。并且用LALRW将碳床处理后水稀释至约ERL和1/10 ERL。每个浓度重复两次，该浓度的PPC也重复两次，然后用β-葡聚糖阻断剂重复使用检测。

PPC回收率介于50-200%时，则该稀释度下可以用LAL 或重组方法测量终产品中的内毒素。

后，根据原始EP环试验方案，分别使用含Walkersville水系统原生内毒素（接近产品ERL浓度）的水样对产品进行加标整个实验分为4组，Group1: 1/2ERL不加葡聚糖阻断剂; Group 2:1/2 ERL葡聚糖阻断剂处理，Group3:1/20 ERL不加葡聚糖阻断剂；Group 4 1/20 ERL葡聚糖阻断剂处理；对以上组别样品分别进行不同程度的稀释，并检测各稀释度下内毒素含量。

对于阿昔洛韦，浊度法、显色法、重组rFC法在接受标准内均能够检测内毒素。

对于庆大霉素，仅有浊度法和重组rFC试剂Ⅰ在接受标准内能够检测内毒素。

对于胰岛素，浊度法、显色法、重组rFC法在接受标准内均能检测内毒素。

对于生理盐水IV，浊度法、显色法、重组rFC法在接受标准内均能够检测内毒素。

总结：

碳床处理后水样中原生细菌的内毒素

• 碳床处理后水样含有低水平的内毒素（约7U/mL）
• 碳床处理后的水样含有低于LOD(<100pg/mL)水平的β-葡聚糖
• 所有方法（LAL和rFC）均可检测到碳床处理后水样中的原生微生物内毒素

检测产品中的原生细菌内毒素

• 所有方法均可检测出被原生细菌内毒素污染的产品
• 试剂的选择取决于产品