瑞孚迪（Revvity） 影像解决方案助力炎症探针开发

巨噬细胞在宿主防御和免疫过程中发挥着至关重要的作用。在不同的微环境中，静息巨噬细胞极化为M1（促炎）或M2（抗炎）巨噬细胞。M1巨噬细胞在感染或组织损伤期间会被脂多糖 （LPS） 激活，它们产生多种促炎细胞因子以及免疫反应。通过分子生物学方法可以研究巨噬细胞不同状态。然而，巨噬细胞在活体内动态变化的行为仍然知之甚少。因此，开发活化的M1巨噬细胞高度特异性的探针，能够更好地了解巨噬细胞的功能和动力学以及炎症条件下治疗干预的细胞反应。

M1巨噬细胞进行代谢重新编程，增强糖酵解，以促进细胞因子产生增加，响应炎症信号。寻找能够介导巨噬细胞中糖酵解和M1极化的新靶点成为新成像技术发展的关键。N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）是离子型谷氨酸受体，主要作用是控制中枢神经系统的突触可塑性。它们在学习、记忆和神经元成熟中起着重要作用。然而各种类型的人类癌症和巨噬细胞中检测到NMDAR的证据也越来越多，如NMDAR受体介导的钙信号通路产生活性氧（ROS），导致巨噬细胞中COX-2表达增强。这也提示NMDAR如何在M1巨噬细胞极化中发挥作用，以及它们是否可以应用于监测各种炎症性疾病的炎症反应是值得研究的。

首先，研究人员发现NMDAR在LPS处理的巨噬细胞中过表达，随后诱导M1巨噬细胞极化。从机制上讲，NMDAR介导Ca2+的积累，从而参与到LPS通过上调PI3K/AKT/mTORC1信号传导进行糖酵解。

基于NMDARs在M1巨噬细胞极化中的生物学相关性，研究人员认为NMDARs可以成为炎症性疾病中M1巨噬细胞分布动态可视化的重要靶标。通过引入NMDAR抗体和红外荧光染料FSD Fluor™ 647，制备了NMDAR靶向成像探针NMDAR-FSD Fluor 647简称为N-TIP。同时，为了进行特异性研究也制备了同型对照兔IgG单克隆Isotype-FSD Fluor™™ 647简称为I-TIP。

借助Operetta CLS的40倍水镜进行Z轴扫描，并利用Harmony 4.9软件进行3D重建和数据分析，建立体外分析方案。采用基于这种3D的成像技术，能够可视化成像探针的细胞表面结合来确定N-TIP在LPS刺激的BMDM（鼠骨髓来源巨噬细胞）细胞膜上的功能结合（下图）。使用这种基于3D的成像方法，我们可以清楚地识别测试细胞的细胞膜（绿色）、细胞核（蓝色）、细胞质（白色）和特异性结合损伤的I-TIP或N-TIP（红色）。当应用I-TIP时，在完整的BMDM和LPS刺激的BMDM中无法检测到红色信号。然而，在完整BMDM和LPS刺激的BMDM中都观察到N-TIP结合损伤（红色信号）。而且，LPS刺激的BMDM中的红色信号明显高于完整BMDM。随后，研究人员也用流式进行了验证。

基于N-TIP与M1极化巨噬细胞选择性结合的发现，接下来评估了使用N-TIP作为活体小鼠炎症反应的新型显像剂的可行性。对于炎症模型，采用了LPS诱导的炎症和CG诱导的炎症，这在一些炎症研究中被广泛用。

LPS炎症诱导后，通过静脉注射给予小鼠N-TIP，并在指定时间测量体内荧光。正如预期的那样，在注射N-TIP后5小时，LPS注射的爪子中显示发炎的病变，但在PBS注射的爪子中没有。LPS诱导的发炎病变可观察到至24h。然而，当应用I-TIP时，对照爪和LPS注射爪之间的FL信号没有差异。

同样，在CG诱导的炎症的情况下，可以首先使用N-TIP在炎症后5小时检测发炎的病变，并持续到24小时。I-TIP无法区分对照和发炎病变。我们进一步使用IVISense Cat B 680 FAST（一种用于检测炎症病变巨噬细胞的探针）和N-TIP进行了体内成像研究。用N-TIP观察到的发炎病变与用IVISense Cat B 680 FAST观察到的病变相当，这表明NMDAR-flour 647可用于追踪促炎性巨噬细胞。

之后，研究人员探讨N-TIP介导的巨噬细胞成像方法是否具有评估抗炎剂在活体小鼠中的治疗效果的潜力。选取在临床前和临床中已被广泛用于治疗炎症性疾病的DEX作为研究对象。建立CG诱导的炎症，然后通过腹腔注射进行DEX治疗，以评估DEX的治疗效果。在炎症诱导后长达24小时的发炎病灶中检测到强荧光信号。与对照小鼠相比，DEX处理显着降低了发炎病变的荧光信号。进一步证实了N-TIP的生物分布。与体内研究结果一致，体外成像显示CG注射的爪子中存在强烈的荧光信号且DEX处理的小鼠的显着减少。

以上结果表明NMDAR介导的糖酵解在M1巨噬细胞相关炎症中起着关键作用。并且，基于NMDAR开发的靶向成像探针可能有助于体内炎症反应的研究。瑞孚迪的高内涵和活体成像的技术，提供给研究人员新的研究工具，从而在体外和活体内对相关探针的效果进行全面评价。