瑞孚迪筛选评价方案助力铁死亡药物发现与机制研究

细胞死亡在生物体的发育和稳态维持中起着关键作用。细胞死亡可以是主动调节的程序性死亡，也可以由于不可控环境引发的细胞坏死。在程序性死亡的通路中，铁死亡是一种独特的脂质过氧化依赖性细胞死亡形式。在过去的十年中，铁死亡已成为一个高度新兴的领域，对各种疾病的发生和发展都有影响。目前，已经发现有多种类型药物能够诱导铁死亡发生，比如IKE可通过抑制system xc-、引起谷胱甘肽耗竭、脂质过氧化并诱导铁死亡。除了发现很多通过GXP4关键的信号分子通路的药物外，也发现了GPX4非依赖性铁死亡通路的药物。虽然已经发现了许多铁死亡调节途径，转录和代谢过程在参与铁死亡调节方面的具体机制还没有得到完全的解释。

为了发现铁死亡的新型细胞调节因子，研究人员筛选了3684个具有已知靶点和作用模式的小分子库。在用筛选库的化合物预处理 HT-1080 细胞后，IKE 诱导铁质细胞死亡。评估细胞活力，每种达到高于指定阈值活力的化合物视为目标化合物。利用瑞孚迪（Revvity）高通量药物筛选工具搭建的平台，将HT1080细胞接种到CulturPlate 384微孔板中，Sciclone G3液体工作站进行细胞处理和药物刺激，并利用EnVision 2104多标记酶标仪检测CellTiter-Glo测定的发光信号来评价。

在这16种潜在的铁死亡抑制剂中，有Turofexorate和 Fexaramine（法尼醇 X 受体激动剂），以及已知的铁死亡抑制剂Ferrostatin-1。为了进一步验证这些目标化合物。是否为铁死亡抑制因子，用相同的实验方案利用Envision进行了10个剂量反应分析，由于缺乏可重复的功效，又剔除了六种化合物。

为了验证这些化合物是铁死亡选择性，对相关化合物进行了细胞凋亡和坏死性凋亡试验。对于细胞凋亡测定，使用星形孢菌素诱导细胞死亡;坏死性凋亡细胞死亡是通过 TNF-α、SMAC模拟物LCL-16和泛半胱天冬酶抑制剂 Z-VAD-FMK的混合物诱导的。结果表明除ATT外，选择的化合物都无法挽救经历细胞凋亡或坏死性凋亡的细胞，表明它们对铁细胞死亡的选择性作用。我们还测试了选择的铁死亡抑制化合物对III类铁死亡诱导剂FIN56的效果的影响。几乎所有化合物都显示出对FIN56诱导的铁死亡的保护作用，化合物Turofexorate和fexaramine效果尤为显著。这些方式都是以相关药物诱导后，利用Envision检测相关细胞活力。最后也用流式结果进行了验证。

Turofexorate和Fexaramine是已知的FXR合成激动剂，FXR是一种核受体，可作为肝脏、肾脏和小肠中胆汁酸的传感器。在RSL3和IKE处理的宽浓度范围内，通过Turofexorate或Fexaramine激活FXR可挽救细胞免于铁死亡的细胞。

同时，FXR与类视黄醇X受体 （RXR） 形成二聚体从而发挥作用。为了测试FXR-RXR二聚化是否是实现抗铁死亡作用所必需的，我们用铁死亡诱导剂RSL3或IKE处理HT-1080细胞，并添加Turofexorate或Fexaramine以挽救细胞的铁死亡。此外，我们用RXR拮抗剂HX 531（RXRi）处理细胞。我们观察到添加RXR拮抗剂后显著剂量依赖性致敏，表明仅激活FXR不足以抑制铁死亡细胞死亡，需要FXR-RXR二聚化协作。以抑制铁死亡。

为了模拟更接近生理条件，在HT-1080微球体中诱导铁死亡，并用Turofexorate或Fexaramine处理它们。RSL3诱导的铁死亡影响了微球的形成。而与FXR激动剂的联合处理导致完整的球状体与DMSO或铁抑素1 处理的对照相同。利用Operetta高内涵图像分析测量球体宽度与长度之比的结果证实了铁死亡诱导球体和药物抑制铁死亡球体之间的显着差异。

后续为了验证相关作用机制，也利用了Envision的光吸收，荧光，化学发光等模块对相关药物的抗氧化，稳定性等进行相关的检测。

最后，分别利用离体原代小鼠肝细胞和诱导的多能干细胞（iPSCs）分化为功能性人肝细胞进一步验证相关化合物铁死亡的重要调控能力，分别利用酶标仪和高内涵进行相关指标的检测。

总结

核受体FXR是一种有效的铁死亡转录调节因子，通过上调许多铁死亡抑制基因来抑制脂质过氧化和铁死亡。

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本工作利用瑞孚迪的高通量筛选工具和分子细胞评价系统，详细解释了各种模型内与细胞死亡相关的多种机制。

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