小动物活体光学成像技术在心血管疾病研究中的应用

Revvity小动物活体光学成像技术已在生命科学基础研究、临床前医学研究及 药物研发等领域得到广泛应用。在众多应用领域中，心血管疾病是目前研究的热点领域之 一。常用于心血管研究的光学标记方法包括：1.利用荧光虫荧光素酶（FireflyLuciferase） 或荧光蛋白作为报告基因，通过标记特定基因而研究心血管疾病相关基因在心血管疾病中 的作用；2.通过外源注射功能性荧光探针，观测心血管疾病发展过程中的分子变化。应用 小动物活体光学成像技术进行心血管疾病研究主要集中在三个方面：1.应用生物发光技 术，研究细胞治疗心血管疾病效果；2. 应用功能性荧光探针，了解疾病发展的分子机理 和药物治疗心血管疾病的效果；3.心血管疾病相关基因的作用及其治疗。下面将对一些具 体实例进行阐述：

一．应用生物发光技术，研究细胞治疗心血管疾病效果

通过细胞示踪，可以了解细胞在心脏的分布并且了解心脏的调控机制。新型的报 告基因（triple-fusion，TF）包括萤火虫荧光素酶，单体红色荧光蛋白和缩短的胸苷激酶。 TF 报告基因体外转染鼠胚胎干细胞，然后注射胚胎干细胞到裸鼠心肌层。Revvity的 IVIS成像系统显示的生物发光成像和正电子发射层断成像（PET）有很强的相关性，并 且能够监测移植后胚胎干细胞存活，增殖和迁移（下图）。

上图：移植含有TF报告基因的胚胎干细胞到无胸腺的裸大鼠心脏。使用生物发光（a，上图）和PET（a， 下图）纵向监测胚胎干细胞在心脏内移植后的存活和增殖。（b &c），定量分析生物发光和PET成像的强 度，之间有很强的关联性。

二．应用功能性荧光探针，了解疾病发展的分子机理和药物治疗心血管 疾病效果

血管疾病发展过程中伴随着分子表达的改变，比如基质金属蛋白酶的表达特异性升 高，因此通过观测体内分子的改变能够判断心血管疾病的发展和治疗效果。研究发现基质 金属蛋白酶 (Metalloproteinases, MMPs) 在动脉粥样硬化中高度聚集，应用 Revvity的 MMPSense 探针并通过IVIS Spectrum 仪器成像显示人动脉粥样硬化中金属蛋白酶的活性。 下图说明，应用MMPSense探针能够检测人颈动脉内膜切除手术的动脉粥样硬化斑块。

在apoE−/− 心血管疾病小鼠模型中，大动脉根的组织蛋白酶活性（ProteaseSensor， PS）升高（左下图）。使用Revvity的Prosense，IntergrinSense 和 CatBFast 探 针分别对心 血管疾病中大动脉根的组织蛋白酶和整联蛋白αvβ3 活性进行观测。如右下图 所示，活体 和体外组织的成像结果相一致（使用Revvity的FMT小动物活体荧光断层 成像系统。

Atorvastatin（阿托伐他汀）可以降低炎症性单核细胞的募集和血管细胞粘附分子 的表达，而且斑块的组织蛋白酶主要来源自于炎症性单核细胞和血管细胞。如下图所示， Revvity的FMT小动物活体荧光断层成像系统显示出Atorvastatin能有效治疗 apoE−/− 心血管疾病小鼠模型。通过Atorvastatin治疗后，主根动脉的组织蛋白酶活性下 降。

三．心血管疾病相关基因的作用及其治疗

利用小动物活体光学成像，能够研究在活体动物水平上心血管疾病相关基因在其 发展过程中的作用。利用生物发光技术进行心血管疾病相关基因的研究，主要用基因-荧 光素酶的共表达载体，通过荧光素酶产生的生物发光信号反映该基因的表达情况，研究 该基因的相关作用。

NF-κB是细胞核内的转录因子，能被炎症性的细胞因子(TNF, IL-1β, IL-6, IL-8)激 活。下图所示，科研人员使用荧光素酶NF-κB转基因小鼠研究心肌梗塞，冠状动脉结扎 小鼠(Myocardial infarction)中的NF-κB基因表达水平相对于假性手术处理的对照小鼠 (Sham)显著升高。研究表明NF-κB基因在心肌梗塞的发展中起了重要的作用。

使用NF-κB转基因小鼠进行同种异体血管化心脏移植的研究。Revvity的IVIS 成 像系统显示野生型 Balb/c 心脏同种异种移植到萤火虫荧光素酶标记 NF-κB 转基因 C57BL/6 小鼠，NF-κB 的基因表达水平 明显提高，说明NF-κB在同种异体移植中被激活 (下图 A)。CD154 抗体（MR1）治疗可以 有效地提高同种异体血管化心脏移植后受体小 鼠的耐受性和存活率，并且抑制NF-κB基因 表达水平。然而服用CpGDNA结合Toll样 受体9，提高NF-κB表达水平并且抑制CD154 抗体治疗效果（下图B）。

荧光素酶标记的低氧报告基因载体系统（Doubleoxygen-sensingvectorsystem, DOSVS）心肌内注射到小鼠心脏。通过间断性缺氧实验，研究人员使用 Revvity的IVIS 成像系统观 测低氧报告基因表达的变换。下图所示在心脏缺氧（On）情况下，低氧报告 基因表达升 高；然而在常氧条件（Off）下，低氧报告基因表达下降。实验证明低氧报告 基因可以用来 监测心脏缺氧或者局部缺血的产生和发展。