小动物活体光学成像技术在感染性疾病研究中的应用

Revvity小动物活体光学成像技术已在生命科学基础研究、临床前医学研究及药物 研发等领域得到广泛应用。在众多应用领域中，感染性疾病研究是活体光学成像技术的 应用热点之一。在应用活体光学成像技术进行感染性疾病研究中，常用的标记方法及应 用领域包括：1、利用萤火虫荧光素酶基因、海肾荧光素酶基因或细菌荧光素酶基因标 记细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原体，在活体水平观测这些病原体在动物体内的感染 情况及抗生素、疫苗等药物的治疗效果；2、通过荧光素酶基因或荧光蛋白基因标记 免疫细胞，以及利用特定基因-荧光素酶基因转基因动物，观测病原体感染所引发的机 体免疫应答及致病机理。下面结合一些具体实例进行阐述：

一.长时间观测病原体在动物体内的动态感染情况

利用PCR、免疫切片等传统方法对感染性疾病进行研究时，需要耗费大量的人力物 力，且不能实现在同一只活体小鼠中长期观测病原体的动态感染情况，因而无法获得准 确的重复性数据。小动物活体光学成像技术的出现，使得研究者能够通过一定的方式对 细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原体进行光学标记，并利用活体光学成像系统长期观测 病原体在体内的动态感染情况，在节省实验耗材及简化实验操作的同时，可获得更加直 观准确的实验结果。

在观测细菌感染方面，研究者既可利用萤火虫荧光素酶基因、海肾荧光素酶基因等 常用于标记真核细胞的报告基因进行标记，也可利用从某些发光细菌中提取的lux发光 基因操纵子进行标记。后者的好处是，lux 操纵子中已含有表达荧光素酶及其底物的序 列，因此无需再外源注射底物即可成像。Revvity提供多种商业化的经细菌荧光素酶基 因标记的生物发光细菌菌种（如下图所示）：

研究者通过购买这些生物发光细菌，即可立即开展相关研究，无需自行标记。如 Hardy 等利用 IVIS 系统观测了细菌荧光素酶基因标记的单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）在小鼠体内的时空分布，如下图：

上图：应用IVIS系统观测不同时间点李斯特菌在小鼠体内的感染情况。A.尾静脉注射；B.口腔注射。

研究者在通过尾静脉注射李斯特菌感染多只小鼠后发现，几乎在所有被感染小鼠中，该 细菌都会特异性分布于小鼠胸部，经手术将发光组织取出后发现，细菌主要集中于胆囊 内腔（the lumen of the gall bladder），如下图所示。细菌在胆囊内腔的存留是一个非常 危险的信号，因为胆囊内腔由于含有高浓度的胆汁而导致免疫细胞无法进入发挥免疫保 护作用，并且胆囊本身又对抗生素具有抵抗性，因此，细菌可以在此区域长期潜伏并随 时发作

上图：应用IVIS系统观测到李斯特菌在胆囊内腔的特异性分布。左：感染25只小鼠，在24只中观测到李 斯特菌在胆囊内腔的分布；右：将胸部发光组织取出后确认为胆囊内腔。

研究者接下来探讨了李斯特菌在胆囊内腔的分布是否具有传染性。由于胆囊在机体未进 食时会大量存储由肝脏分泌的胆汁而处于扩张状态，而当机体进食后，胆囊会收缩并将 胆汁通过胆管排入小肠而辅助对食物中的脂肪进行消化。因此，研究者通过对被感染的 小鼠禁食后再喂食，观测李斯特菌是否能够通过胆汁排泄途径而进入消化道。结果显示， 李斯特菌确实能够通过胆汁排泄途径而进入小肠（如下图），并可能通过消化道的排泄 进入外界环境而具有传染性。综上所述，研究者利用活体光学成像技术，系统的研究了 李斯特菌在小鼠体内的感染分布、潜伏及潜在的传染途径，为该类疾病的治疗提供了依据。

上图：应用IVIS系统观测李斯特菌经胆汁排泄途径由胆囊进入消化道。B、C分别为再喂食后5min及50min 成像结果。

对细菌生物膜（Bacterial Biofilm）的研究也是细菌感染研究的一大热点。细菌生物 膜是细菌在生长过程中附着于物体表面而形成的由细菌细胞及其分泌的含水聚合性基 质（主要为胞外多糖）等所组成的膜样多细菌复合体。生物膜是细菌适应生存环境而形 成的与游走态细胞相对应的存在形式，它具有很强的抵抗机体免疫和抗生素的能力，在 临床上形成难治性感染。Bernthal 等通过在小鼠下肢股骨远端插入接种了生物发光金黄 色葡萄球菌（S. aureus）的不锈钢针，模拟了人关节成形手术后经常发生的细菌生物膜 形成，并用IVIS系统及变压扫描电镜（VP-SEM）观测了细菌感染及生物膜的形成（如 下图）。这种实验模型的建立为开发有效的治疗手段及抗菌剂提供了有力工具。

上图：通过模拟实验观测关节成形术后S. aureus的感染及生物膜的形成。A.模拟实验示意图及钢针移植后 X光成像结果；B.应用IVIS系统观测不同数量生物发光S. aureus在关节处的感染情况；C.应用VP-SEM观 测细菌生物膜的形成。

在病毒研究方面，研究者通常将萤火虫荧光素酶基因插入病毒DNA中标记病毒， 进而观测病毒在活体动物体内的动态变化。Milho等人利用IVIS系统观测比较了经不同 途径感染小鼠的鼠源疱疹病毒（murine herpesvirus-4, MuHV-4）在小鼠体内的感染分布 情况。结果显示，经鼻腔感染的病毒，在感染早期主要分布于小鼠的鼻腔及肺，随着时 间的延长，病毒将集中分布于颈部淋巴结及脾等淋巴组织；经腹腔接种的病毒，在感染 早期分布于腹部的多个器官（如肝、脾、肾、肠、生殖系、隔膜），所时间的延长，病 毒将集中分布于脾及肠系膜淋巴结。因此，病毒的不同感染途径可能会引起不同的发病 机制。

上图：应用IVIS系统观测MuHV-4病毒经不同途径接种后的感染情况。上，活体成像结果；下，将不同器 官取出后体外成像结果。

与细菌、病毒感染研究类似，研究者也可通过荧光素酶基因标记寄生虫，观测其在 活体动物体内的感染情况。如Claes等人利用IVIS系统观测了经海肾荧光素酶基因标记 的布氏锥虫（Trypanosoma brucei）在小鼠体内的感染情况。体内及体外成像结果显示， 经腹注射后，布氏锥虫选择性分布于睾丸。布氏锥虫在睾丸的选择性分布可能会使其避 开药物的作用，因为许多药物无法通过睾丸-血管屏障而进入睾丸。随后的给药实验印 证了这种推断，在布氏锥虫感染小鼠 5天后，用虫草素（cordycepin）连续进行三天处 理，停药后在第15天发现睾丸处重新出现布氏锥虫生物发光信号。这一研究为开发治 疗布氏锥虫感染的有效药物提供了依据。

上图：应用IVIS系统观测布氏锥虫在小鼠体内的感染情况。左，感染后不同时间点活体成像结果；右上， 取出睾丸后体外成像结果；右下，虫草素对布氏锥虫的治疗效果观测。

近些年，研究者也开始利用荧光素酶基因标记真菌，并通过活体光学成像系统观测 真菌在动物体内的感染情况。Doyle等人应用萤火虫荧光素酶基因标记了从临床病例中 获得的白色念珠菌（Candidaalbicans），将该真菌尾静脉注射入小鼠体内构建慢性败血 症感染模型，利用 IVIS 系统观测了生物发光白色念珠菌在小鼠体内的感染情况。体内 及体外成像结果显示，随感染时间的延长，该菌主要分布于小鼠肾脏（如下图）。

上图：应用IVIS系统观测白色念珠菌经尾静脉注射后在小鼠体内的感染情况。A.体内成像结果；B.体外成 像结果。