体外药效评价方法有哪些？

新药研发是一个长周期、高投资、高风险的过程。一款新药在进入临床试验之前，非临床阶段的深入、系统研究至关重要。临床前药理药效是其中的核心环节，药效研究涉及药物的基本类型、作用机制、选择性、量效关系等方面。

体外药效评价

抗体药物的活性测定是对药物的有效性和药物效价的测定，是抗体药物评价体系中至关重要的部分。抗体药物的体外活性分析方法分为两类:抗原结合能力测定和生物学活性测定。抗原结合能力测定常用的方法有ELISA法、流式细胞法等;生物学活性测定包括ADCC/ADCP/CDC检测试验、细胞增殖抑制、杀伤活性、凋亡以及细胞因子释放试验等

抗原结合能力测定

目前研发生产中主要通过测定抗体的抗原结合能力来评价活性，常用的方法有ELISA法和流式细胞仪法。

免疫测定法通常用于确定通过杂交瘤技术产生的单克隆抗体的同型。人们越来越需要高效、灵敏的检测方法来确定这些单克隆抗体的同型。进行免疫测定最常用的技术是ELISA，ELISA是一种经过时间验证的方法，但需要多个耗时的步骤，可能导致数据的准确性受到影响。AlphaLISA是一种化学发光均质微珠技术，不需要洗涤或分离步骤，因此与ELISA相比具有显著优势。

AlphaLISA检测通常在96孔或384孔板上进行，样品体积低至5μL，减少有价值待测样品的消耗。总检测时间小于3小时，是最常用ELISA检测时间的一半。在此，我们报告了使用自动化开发几种新的AlphaLISA检测方法来检测杂交瘤中产生的人IgG单克隆抗体的同型。

文献来源：Use of the JANUS Automated Workstation to Develop Efficient AlphaLISA Immunoassays for Isotyping Human Monoclonal Antibodies

生物活性测定

ADCC抗体介导细胞毒性

单克隆抗体药物是目前药物研发的新热点，与小分子药物相比，抗体类药物具有高效、低毒、半衰期长等特点。抗体介导细胞毒性（ADCC）是引起抗体类药物不良反应的一个关键限制因素。Lazar G. A. 等人在建立了以Alpha技术竞争性验证抗体Fc片段突变体与FcɤRs亲和力检测的体系，对计算机模拟设计出的上百种突变体，进行快速、高效的特异性检测，以发现特异性更高、副作用更小的单克隆抗体药物。

Binding of Fc variant Abs to FcγRs measured by competition AlphaScreen. Binding of alemtuzumab Fc variants to human V158 (Left) and F158 (Right) FcγRIIIa.

Alpha技术，是基于一对微珠的均相亲和检测方法，是一种非放射性、均相、可代替传统繁琐ELISA技术的高效检测方法，并可直接检测血清、血浆或细胞裂解液等复杂生物样品。Alpha检测须配置高强度的激光光源，以激发出供体微珠上足量的单体氧分子。单体氧分子和受体微珠发生级联化学反应释放出光子。该检测光信号为化学发光，虽背景低，但源信号强度较荧光弱，因此需要配置超灵敏PMT以达到更好的检测效果。Revvity EnSight多模式酶标仪具有超灵敏HTS Alpha 模块在配置激光光源和超灵敏PMT的基础上，又对光源和PMT进行了优化，因此其信噪比更高、检测速度更快。

细胞活力检测

ATP（三磷酸腺苷）是细胞活性的标志物，其仅存在于具有代谢活性的细胞内。因为细胞经历坏死或凋亡时，ATP浓度会迅速下降，所以ATP是监测细胞毒性、杀伤、抑制和增殖的一种很好的指示剂。

逐典细胞活力检测试剂盒

本品为开盖即用型试剂，只需取与待测样品等体积的试剂加入到含细胞的测试孔中。室温震荡2-5分钟使细胞裂解充分以及混合均匀，待室温反应10分钟后发光信号达到最强读值后即可进行检测读值。

免疫细胞介导的特异性杀伤

在肿瘤免疫疗法的开发中，无论是有效性还是安全性评价，还是进一步的抗体机制如ADCC等研究，都离不开检测免疫细胞介导的特异性杀伤。与直接的细胞活力检测不同，基于免疫细胞的杀伤是细胞-细胞相互作用的结果，因此，对应的检测方法必须能够特异区别靶细胞（肿瘤细胞）和效应细胞（免疫细胞）。针对区分的需求，目前有多种检测方法，例如51Cr释放法，DELFIA EuTDA细胞毒法和萤火虫报告基因法等。

化学发光的检测信号是酶促反应过程中释放的光子，检测时不需要外界激发光激发，也因此不会触发环境中的自发背景荧光，所以化学发光检测背景干净、信噪比很高。但由于化学发光自身的发光特点，在同等条件下，化学发光的原始光子强度远低于荧光强度检测，所以化学发光需要独立于荧光之外的超敏感检测模式，放大检测光子信号、减少空间串扰，才能在实验中得到更好的检测窗口和信噪比。

EnSight多模式酶标仪采用独立的超敏感PMT，免光纤紧邻样品孔上方，显著提高检测灵敏度。超敏感化学发光采用优化免光纤独立光路，配置化学发光专用单光子暗电流超敏感PMT检测器，检测器前端带有传感器的优化光圈，可自动探测微孔板高度，实现紧贴微孔板孔口检测，减少信号损失和串扰；采用低暗电流单光子PMT，可提供50～108counts/秒的信号水平；检测时间缩短，读板速度更快，提高实验效率。

CAR-T杀伤效果检测

CAR-T细胞的杀伤活性可通过对靶细胞裂解程度来检测。与51Cr释放法形式类似， DELFIA EuTDA细胞毒法利用荧光放大配体BATDA特异的标记靶细胞。

BATDA加入到细胞培养基中，可以穿过细胞膜，被胞内酯酶裂解成TDA，TDA不能再穿过细胞膜。裂解标记的靶细胞在上清液中释放TDA，然后转移到实验板上，与铕溶液结合生成荧光分子EuTDA。细胞裂解导致EuTDA的增加，因此增加的信号与标记的靶细胞死亡相关。除了灵活性和支持高通量特异性杀伤检测外，DELFIA EuTDA细胞毒法具有TRF技术带来的高稳定性和重复性等优势，已成为主流的细胞杀伤检测技术。

此外，TILs能够杀伤肿瘤细胞，因此检测TILs效率的重要指标之一检测对肿瘤细胞的杀伤能力，Revvity公司能够提供基于TRF技术DELFIA EuTDA检测法。与51Cr释放法形式类似， DELFIA EuTDA细胞毒法利用荧光放大配体BATDA特异的标记靶细胞。BATDA能迅速进入细胞，并在水解作用下形成亲水的TDA留在细胞内，并在靶细胞裂解下释放，和DELIFAEu试剂相结合形成强荧光、稳定的螯合物EuTDA用于检测。除了灵活性和支持高通量特异性杀伤检测外，DELFIA EuTDA细胞毒法具有TRF技术带来的高稳定性和重复性等优势，已成为主流的细胞杀伤检测技术。

细胞因子检测

细胞因子是免疫反应过程中关键的信号转导蛋白，通常为小于80kDa的多肽。在免疫系统内部和其与宿主组织细胞的交流中，细胞因子占据基础而又重要的地位。细胞因子的种类非常多样，并能通过旁分泌和自分泌的形式调控广泛的免疫功能。针对常见的重要细胞因子和分泌蛋白靶点，Revvity具有HTRF，ALPHA和LANCE技术平台，可提供支持免洗的高通量筛选解决方案。相较于传统的ELISA，这些技术具有更出色的灵敏度和动态范围，提升了抗干扰能力的同时极大简化了操作步骤。