客户分享 | Beacon®单B细胞筛选加速困难靶点抗体发现

在近期的网络研讨会中，来自美国MImAbs的科学总监François Romagné博士讨论了针对困难靶点的抗体发现策略。他们使用mRNA免疫和Beacon单B细胞抗体发现平台，加速获得大量针对难以靶向的G蛋白偶联受体（GPCR）和离子通道的具有分子功能多样性的抗体。

从杂交瘤平台到Beacon®单细胞抗体发现

MImAbs是一个专注于发现和表征免疫治疗抗体的研发平台。MImAbs初期建立杂交瘤抗体平台，其平均筛选通量为2000-3000个克隆，从免疫小鼠到纯化得到leads抗体的时间需要4.5个月到5个月（图1）。由于筛选的通量较低，得到最终可用于下游验证的抗体数和抗体多样性可能不足，尤其是针对一些困难抗原的时候。

图1. MImAbs基于杂交瘤的抗体发现流程

MImAbs在2022年初采购Beacon®平台，在过去的两年中已经开展了20余个campaigns，对比发现Beacon®在普通靶点的抗体发现中具有更加快速高效的特征，筛选出的hits数目是杂交瘤的10倍以上（图2）。在针对GPCR和离子通道等困难抗原的campaign当中，Beacon®的单B细胞抗体发现流程更是展现出巨大优势。

图2. MImAbs基于Beacon®的抗体发现流程

GPCR和离子通道抗体发现难点

GPCR（G Protein-Coupled Receptor），即G蛋白偶联受体，是一大类膜蛋白受体的统称，也是人类基因组编码的最大蛋白家族，参与机体发育以及多种生理功能的调控，是重要的药物靶点。GPCR的主体由7段跨细胞质膜的α螺旋结构构成，将信号由胞外转导到胞内。但是其N端的胞外区域只有40aa，其他的胞外的loop则更小。同为跨膜蛋白复合物的离子通道，是继GPCR之后用于药物发现的第二大类膜蛋白。离子通道胞外区不包含N-末端及C-末端，胞外区小且表位有限。这些特征让这两类蛋白缺乏足够的免疫原性来在哺乳动物宿主中产生强大的抗体反应，而且难以表达重组蛋白用于传统的高通量抗体筛选。

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案例一：GPCR抗体发现

在最初针对GPCR的抗体发现，由于使用肽段的免疫效果不佳，无法检测到抗体滴度，改用细胞免疫后虽检测到抗体滴度，但在三个使用杂交瘤的campaign中都没有成功筛选到抗体。研究者在改进免疫方案，使用了全长的mRNA进行小鼠免疫，或mRNA联合细胞进行共同免疫，抗体滴度均得到有效提高（图3）。

图3. mRNA免疫策略得到更高抗体滴度

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然而，在使用共计12只免疫小鼠进行杂交瘤抗体发现过程中，共计筛选了5229个杂交瘤克隆，只找到一个阳性的克隆。而更早的超过10只细胞免疫小鼠的抗体发现则是一无所获。

MImAbs使用同批次免疫的小鼠，利用Beacon®进行浆B细胞抗体筛选，通过基于细胞表达GPCR进行结合检测以筛选阳性克隆。在Expt1（mRNA only）和Expt2 (mRNA+cells)中分别使用两张11k芯片进行抗体筛选，最终得到37个经过体外验证为真阳性的抗体分子（图4）。

图4. 杂交瘤和Beacon筛选GPCR抗体结果

被Beacon®筛选出来的阳性hits的VH和VL序列显示出多样性（图5），前期发现抗体的多样性为后续的选择和开发提供了丰富的资源。

图5. Beacon筛选出的抗体序列的多样性

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案例二：离子通道抗体发现

离子通道蛋白的campaign中只使用mRNA免疫并没有可检测到的抗体滴度。尝试使用细胞免疫或者联合mRNA进行免疫，然而mRNA并没有进一步增加小鼠血清中的抗体滴度。细胞免疫在大多数的小鼠中只引起了接近于背景信号的免疫反应。只有一只小鼠显示出特异性的抗体滴度（#8），连同另外两个低滴度的小鼠，被用于后续基于Beacon®的抗体发现（图6）。

图6. 离子通道的免疫策略和抗体滴度

在免疫效果更高的#8小鼠骨髓和脾脏浆B细胞中，Beacon®发现了30个经过验证为阳性的hits。另外两只滴度较低的小鼠内，Beacon®也筛选到15个阳性hits。其中30对VH-VH通过流式细胞术和瞬时转染表达该靶点的细胞系进行验证，12个VH-VL能够结合表达了对应离子通道的细胞（图7）。后续的研究工作还在进行当中。

图7. 离子通道hits的流式细胞验证结果

在研讨会的最后，François博士总结了Beacon®平台在抗体发现中的优势：

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增加筛选的深度和多样性

• 在每个campaign中，杂交瘤只能筛选2000-3000个克隆。
• Beacon®每次可以筛选40,000个克隆（4张11k芯片）。

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在单细胞层面针对重组抗原和转染细胞进行功能筛选

• 当重组抗原可及的时候，杂交瘤能够提供相对足够的抗体多样性。
• 单细胞FACS只能筛选可包被在微珠表面的可溶性抗原；应用在记忆B细胞，相比于浆细胞分泌的抗体，膜表达IgG亲和力更低。
• Beacon®筛选只测序经过了几层筛选的hits序列：抗原识别、初步的功能（如阻断）或者交叉反应。

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缩短从hit鉴定到重组表达和验证的时间

• Beacon®单细胞操作节省了杂交瘤培养的时间。
• Hits回收（表达为重组mAbs）时无需基因合成。
• 基于Beacon®的流程在8周内完成高达100个hits的小规模生产（数量可以通过增加自动化进一步提高）。