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电转百科指南⑥:CRISPR基因编辑的转染技巧与注意事项(下篇)

时间:2023-11-20 来源:上海玮驰仪器有限公司 阅读:404

02/下篇

Knock-in

对于Knock-in,目前还存在一定的难度,大多数的出版物只能实现10-40%的敲入效率,不同位点也存在差异。Nature Biotechnology今年5月的一篇出版物利用独有的SLEEK (SeLection by Essential-gene Exon Knock-in)技术可以在T细胞上实现超过90%的KI效率,同样在其他常用的免疫细胞如NK,B cell,IPSC等细胞都实现了非常高的KI效率。

对于常规的KI实验,我们依然可以从以下方面考量进行进一步优化:

 

Donor DNA用量的测试

▲ Theodore L Roth et al., 2018

▲ Zelda Odé et al., 2020

 

HA长度

HA的长度会影响KI的效率,但并不意味着越长越好。

▲ Zelda Odé et al., 2020

▲ Soyoung A. Oh et al., 2022

 

HA修饰

▲ Brian R. Shy et al., 2021

▲ Jonas Kath et al., 2022

 

特殊成分提高HDR效率的测试

也有文献结果表明PGA对KI的效率没有帮助,仅供参考。

▲ Ya-Wen Fu et al., 2021

▲ David N. Nguyen et al., 2020

 

选择dsDNA或ssDNA或AAV载体进行KI

dsDNA会随着用量的增加显著增加对细胞活率的影响。

▲ Theodore L Roth et al., 2018

 

HDR Enhancer

▲ Jonas Kath et al., 2022

 

甚至HDR, RNP, 细胞的混匀顺序也可能会对结果造成影响

▲ Theodore L Roth et al., 2018

 

电转前后培养体系

▲ Theodore L Roth et al., 2018

 

Nucleofection 条件优化

通常可以参考KO的条件进行KI实验,但依然可以依照具体的实验需求调整。

▲ Theodore L Roth et al., 2018

▲ Soyoung A. Oh et al., 2022

 

对于Knock-in,还可以通过其他手段提升结果,如PAM and Track mutations, 具体内容可以参考如Cas蛋白或sgRNA供应商。

 

通常KO不会对细胞的活率产生太大影响,但是对于KI,需要用到donor DNA,如dsDNA,或者使用更强的电转染条件,这些可能会导致活率的负面影响。