电转百科指南⑤：CRISPR基因编辑的转染技巧与注意事项（上篇）

电转百科指南①：如何提高电转染效率？技术专家总结以下八点！

电转百科指南②：不同细胞的电转技巧，收藏了慢慢看！

电转百科指南③：手把手教程来了，20种常用细胞的实验方案

电转百科指南④：每日问候你的细胞转染结果好吗，支原体污染要避免

本周第五期电转百科我们将更进一步，为大家带来CRISPR基因编辑的内容，本章内容将分为Knock-out与Knock-in上下篇，请继续关注下一期的后续！

01/上篇

Knock-out

Lonza Nucleofector™核转染系统可以广泛应用于多种不同的场景，在不同的应用场景下通常会使用DNA或RNA或蛋白进行外源基因的递送，以实现特殊的应用需求。

以CRISPR系统为例，全球有大量的客户使用Lonza Nucleofector™核转染系统开展基于CRISPR系统的基因编辑相关工作并发表文章且逐年递增。

▲ Google Scholar Search for ‘Nucleofector CRISPR’, July 2023

· 对于CRISPR的转染，即可以通过表达Cas9的质粒系统如PX458载体来实现“剪刀” Cas9的递送，也可以通过Cas9 mRNA的方式在细胞质中直接翻译，与sgRNA形成复合物后再进入细胞核进行基因组编辑。当然我们也可以在转染前提前将Cas9蛋白与sgRNA进行孵育形成RNP复合物，再通过电转染递送到细胞内，直接进入细胞核进行基因组编辑。

· 对于CRISPR应用，主要用于knock-out或Knock-in

Knock Out：尽管Knock-out已经比较容易实现高效的敲除效率，但对于陌生的细胞或者全新的位点依然需要进行适当的调整。包括但不限于以下方面：

不同的Nucleofection条件测试

Lonza为多种常用的细胞提供预优化的电转程序，电转程序与细胞相关，通常来说，即使电转不同的核酸底物(DNA，RNA，蛋白等)无需对电转程序进行调整，但在越来越多的原代细胞转染中，使用RNA或RNP进行细胞基因编辑时，可以通过对程序进行适当的微调，以获得更高编辑效率的同时，更好的维持细胞的活率及功能。对于常见的T cell，HSPC，NK，DC等免疫细胞可以对Nucleofection脉冲条件进行适当调整。

▲ Akiko Seki et al., 2018

不同的crRNA/sgRNA测试

对于同一基因不同的sgRNA表现可能不同，目前已有大量设计sgRNA序列的工具，部分工具也可以为其打分，但通常还是建议尽可能测试多个sgRNA以确保实验结果。甚至结合多条sgRNA对同一基因进行编辑。

▲ Akiko Seki et al., 2018

不同Cas9蛋白的测试

对于不同供应商的Cas9蛋白也存在切割活性的差异，对于WT Cas9和一些经过优化的Cas9蛋白也会导致编辑效率的差异。

▲ Akiko Seki et al., 2018

▲ Liyang Zhang et al., 2021

Cas9用量测试

除对不同Cas9蛋白来源的测试外，Cas9的用量也是需要在试验优化中考量的因素。

▲ Liyang Zhang et al., 2021

Cas9:sgRNA比例测试

对于Cas9蛋白和sgRNA形成的蛋白复合物，以何种比例添加进行孵育转染必定也是重要的因素。在大多数的出版物中，Cas9:gRNA的比值在1:1.2 - 1:5之间。

▲ Akiko Seki et al., 2018

Electroporation Enhancer

有时可以考虑使用electroporation enhancer以实现更高的编辑效率。

▲ Matteo Martufi et al., 2019

市面上大多数提供Cas蛋白或sgRNA的供应商通常也会提供一份详细的protocol，可以优先参考这些protocol或相关的paper。除上面提到的方向外，供体差异，转染的时间点，对于免疫细胞(如T细胞)，何种激活剂激活也可能会对最终的结果造成影响。