Simoa 如何实现多重检测？

Simoa®单分子蛋白检测技术由现任于哈佛大学医学院的David Walt教授作为科学创始人于2007年创立。David Walt 是美国的工程院，艺术院和医学院 三院院士。2010年，David Walt 将 Simoa® 技术以封面文章的形式发表在《 Nature Biotechnology》上，此技术开始为大众所知并引起业界轰动。

Simoa®特点是其超高的灵敏度，较传统ELISA方法能够高出3个数量级，达到飞克级别(fg/ml)甚至更低，因此可以直接在外周血中检测健康人群中的蛋白质生物标志物的基线表达，而不是传统方法学的疾病发生后，实现探索冰山下更广阔的蛋白检测。

那Simoa技术是如何轻松实现多重检测呢？我们来一探究竟！

Simoa单分子蛋白检测技术工作流程

Simoa@技术是一项基于磁珠的实验技术,磁珠直径为2.7um,在磁珠表面,捕获抗体会通过化学反应偶联到磁珠上。每个磁珠表面有约250000个结合位点用于和捕获抗体结合。结合了抗体的磁珠会和目的抗原结合,然后加入生物素标记的检测抗体,形成双抗夹心的免疫复合物。生物素标记的检测抗体会进一步和亲和素标记的酶结合,Simoa@使用的是半乳糖甘酶。此时,如果样本中含有目标抗原,则磁珠会带有酶标记,而不含有目的抗原的磁珠则保持无标记物。

接下来,系统会洗涤磁珠以除去任何非特异性结合的蛋白质。然后加入酶反应底物,Simoa@技术的真正关键之处就在于此时含有免疫复合物的磁珠转移到Simoa@光盘上每个光盘有24个芯片(Array),而单个Array表面有239000个小孔(wel),每个小孔的直径是4.25um,刚好一个磁珠落入一个小孔,小孔的反应体系是50飞升,基于磁力的作用磁珠会迅速沉入小孔中,然后系统会在Array表面推一层油,通过这一层油一方面将部分多余的磁珠去除,另一方面将荧光信号很好地密封在小孔中(不易信号扩散和交叉反应)。

由于50飞升的反应体系极小,比传统100ul的体系小了20亿倍,此时即使一个的目的蛋白分子其催化底物产生可以产生约3000个荧光分子,被仪器的CCD摄像头捕获并进行数字化成像分析。所以Simoa@仅需要一个蛋白分子就可以达到检测底限,几乎没有信号的稀释(Diffusion defeated),实现单分子的检测。

Simoa 与传统 ELISA 的区别

Simoa® 单分子蛋白检测技术「多重检测」原理

Simoa实现多重检测，主要是基于磁珠可以包被不同的荧光的染料。在单重检测的时候，磁珠包被的染料在LED激发后发出绿色荧光，主要通过488通道可以实现落孔磁珠的检测。

在进行多重检测时，整个检测流程不变，但事先会给磁珠包被不用的染料（如下图所示，可以包被浅紫色，深紫色和蓝色），这些磁珠在LED激发后会发出不同颜色的光，比如750发出红光，通过滤光片可以在750，700和647通道检测到这些磁珠发出的荧光，不同染料的磁珠对应包被不同的捕获抗体，比如浅紫色磁珠对应包被Aβ40抗体，绿色磁珠对应包被Aβ40抗体Aβ42，蓝色磁珠对应包被NfL抗体, 紫色磁珠对应包被GFAP抗体，这就明确了每一种磁珠对应的检测靶标的信息。

在检测过程中，对于每个样本孔，总计会有7张照片的拍摄。第一张是白光，主要用于拍摄每个芯片中所有的孔；第二张，是在577通道，用于检测酶催化底物发出的黄光，同时记录时间T0;第三张，拍摄750通道的发光情况，用于检测多重beads信号；第四张，拍摄700通道的发光情况，用于检测多重beads信号；第五张，拍摄通道的发光情况，用于检测多重beads信号；第六张，与第二张通道相同，也是在577通道，用于检测酶催化底物发出的黄光，同时记录时间T2，和第一张间隔30秒时间，如果孔内的确有抗原，酶催化底物，在30秒内，会有荧光信号的增加，当信号增加大于一定阈值认为孔内确实有抗原；第七张，拍摄488通道的发光情况，主要用于检测单重beads信号。通过高清摄像对7张张照片的拍摄和解读，实现了多重目的蛋白的特异性检测。

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