内毒素专题|内毒素检测总出现假阴性？掌握这些才能应万变

在生物制品、医疗器械等产品的整个生产阶段，无论是原辅料、过程产品的过程检测还是终产品的放行检测中，细菌内毒素检测（BET）都是必不可少的环节，如果内毒素检测出现假阴性，那么有潜在内毒素的产品有可能被放行到市场中，引起发热、休克甚至更重大的事故。

小伙伴们是不是也经常被假阴性折磨呢，本期小编带你了解如何应对BET假阴性！

►什么是假阴性

对于凝胶法，当供试品内毒素浓度≥2倍检测试剂的灵敏度，但检测结果仍为阴性，则说明BET假阴性。对于光度法，若内毒素的回收率＜50%，则说明在此试验条件下供试品溶液存在抑制干扰，导致内毒素检测不出来。

►造成假阴性的干扰因素及解决方案

供试品的干扰

• pH值

BET机理是酶促反应，而酶的反应条件相对来讲比较严苛，因此要求供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内，过高或过低的pH都会抑制反应，出现假阳性。

若不在6.0～8.0范围，建议使用厂家提供的缓冲Buffer稀释调节，如Tris Buffer。

• 二价阳离子

内毒素激活鲎试剂中的酶需要二价阳离子，如Mg2+的参与，若供试样品中存在的肝素或EDTA等成分螯合阳离子，二价阳离子浓度不足时，便抑制反应，导致假阴性的出现。为了克服金属离子螯合剂的抑制干扰，可用MgCl2稀释供试品。

与Mg2+不同，Ca2+不会激活BET反应，而是具有非常强烈的抑制作用，因此存在Ca2+的供试品可用LRW稀释。

• 高渗透压

过高浓度的盐或糖溶液会脱去蛋白质中的水分子，使蛋白质变性，出现抑制干扰。可通过稀释供试品去除干扰。

• 酶抑制剂

人血浆中的丝氨酸蛋白酶抑制剂会抑制内毒素激活鲎试剂。可用LRW稀释10倍，再70±2℃加热10 min破坏抑制剂，进而去除干扰。

• 屏蔽内毒素

血浆蛋白组分、电解质溶液和脂质乳剂等有结合内毒素的特性，如脂质乳剂的两亲性对疏水的内毒素具有亲和力，脂类包裹内毒素，使内毒素无法暴露出来，实验结果将出现假阴性。可通过添加分散剂的方式去除抑制干扰。

►操作（包括操作环境）

• 操作

鲎试剂与细菌内毒素反应后形成的凝胶比较脆弱，容易受到震动等剧烈操作而变形，将检测结果误判为阴性。

因此对于凝胶法，在温育过程和取放反应管时一定要轻柔操作，避免安瓶或试管左右晃动，且在保温过程中不可随时取出观察。

• 反应温度

鲎试剂的灵敏度对温度较敏感，反应温度在25~40℃之间，一般设置37°C ± 1°C。温度过高，会破坏鲎试剂，从而达不到检测目的。

►实验耗材、器具

• 检测器具

在稀释标准品等操作过程中要用到一些器具，建议选择玻璃器材，非塑料制品，因为塑料制品容易吸附内毒素，造成BET反应内毒素不足。

• 表面活性剂

高浓度表面活性剂会使鲎试剂中的蛋白质变性，形成抑制。因此所用器具在用洗涤剂清洗后要彻底冲洗干净并灭菌，供试品溶液可通过LRW稀释来降低干扰。

细菌内毒素检测试剂怎么选

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