玮驰分享丨快速了解“单细胞技术”与“传统流式技术”检测胞内蛋白的区别

IsoPlexis的单细胞蛋白组技术不仅可以“向外看”---检测培养单个细胞胞外分泌的细胞因子；也可以“向内看”---检测单细胞水平胞内蛋白。使用细胞内蛋白组学相关panel可以在几天内揭示肿瘤靶向治疗中信号通路变化。

在肿瘤治疗耐药性研究中，研究人员经常通过基因组研究来了解肿瘤的微环境和信号通路，但肿瘤中一些功能的适应性变化没有引起基因层面的改变，所以仅凭基因组学研究很难提供肿瘤治疗耐药性机制的完整信息。单细胞胞内蛋白组解决方案是研究肿瘤信号通路和治疗耐药性基础的关键工具，帮助研究人员进行完整的功能表征。

检测胞内蛋白的区别

传统检测细胞内磷酸化蛋白方法之一是流式细胞术，进行表面抗体标记分型细胞再进行细胞固定破膜，让荧光抗体进入细胞内标记胞内磷酸化蛋白。这听起来不难，但实际有好几个需要考虑的实验步骤。

首先，固定破膜液的选择会影响后抗体标记的效果，还要兼顾表面标记不受胞内荧光抗体的影响。其次是抗体的挑选跟配色方案，不是所有经过验证的抗体都可以不受固定破膜液的影响，标记到胞内磷酸化蛋白；抗体上带的荧光染料也有可能被固定液破坏导致信号不足。如果一次想看好几个胞内磷酸化蛋白，还要考虑抗体之间的特异性不跟其它蛋白交叉反应，以及荧光染料之间的荧光补偿问题。倘若还要考虑表面蛋白标记分型的抗体，整个流式抗体配色方案就要思考设计一整天，更不用说实验后还得根据数据结果优化整个方案了，几次实验下来花费的时间可能就是几周了。总结以上几点，一般流式检测胞内磷酸化蛋白靶标只能是2-5种。

IsoPlexis独特的单细胞胞内磷酸化蛋白质组解决方案针对每个芯片中500-1500个单个细胞，分析每个细胞多达15种磷酸化蛋白。经过反复验证的抗体组合，通过这些信号通路中关键磷酸化蛋白的表征研究细胞信号通路，研究整个信号网络的变化，并揭示关键的适应性耐药途径。IsoPlexis系统还是全自动化运行的，单细胞悬液样本加入微流控芯片后，细胞在芯片中进入单细胞微室、裂解单细胞，微室为磷酸化蛋白检测提供了一个更大的捕获区域（图1），单细胞的分离、裂解，以及细胞内蛋白的检测都由仪器自行完成。

需要特别指出的是流式配色panel设计是一个非常复杂的过程。使用IsoPlexis单细胞检测系统避免了复杂流式配色panel的设计，系统使用了独特的条形码抗体，避免了检测过程中不同蛋白之间的相互干扰。IsoPlexis进行了相关的方法开发，配套的芯片panel已被完全验证和优化，适用于不同的应用方向（图2），不需要研究人员进行优化，可立即使用 。这意味着研究人员不需要耗费可能长达数个月的时间去建立方法，开发panel，再进行实验；只需要几天内就可以得到结果。

应用案例之一：在肿瘤靶向治疗的过程中，一旦对治疗产生耐药性，肿瘤就会复发，必须开发更好的治疗方案。治疗耐药性的表征对于创建有效治疗方案至关重要；因为肿瘤细胞存在异质性，定义和测量每个肿瘤细胞对信号通路的贡献至关重要。通过同时对不同信号通路中关键节点的多达15个磷酸化蛋白进行检测，可以帮助分析多重蛋白之间关联性，评估信号通路是否被抑制，或者新的信号通路是否建立，进一步得到完整的信号通路网络信息，评估治疗方案的耐药性，以确定有效的靶点（图3）。

另一篇应用在Cancer Cell的一篇文章中：利用IsoPlexis的单细胞胞内蛋白组技术，研究人员能够通过分析信号通路中不同磷酸化蛋白的协同关系评估胶质细胞瘤治疗耐药性的产生。研究表明，耐药性可以通过一种非遗传（适应性）机制进行，该机制在单一抑制剂用药后的几天内被激活（图3）。

单一药物治疗后，测量到肿瘤胞内功能的适应性变化提示研究者进行联合治疗，即同时使用多种靶向药物进行治疗，应对单一药物治疗带来的耐药性问题。结果显示多药联用可以有效阻止肿瘤生长（图4）。这种单细胞分析方法为设计更有效的肿瘤联合治疗策略提供了可能。

IsoPlexis单细胞蛋白质组检测技术相比传统方法省去了流式实验方案设计，全自动仪器节省了实验人力物力，更重要的是节省宝贵的样本，使用单细胞胞内磷酸化蛋白质组芯片针对15种磷酸化蛋白捕获相对完整的信号通路网络信息。另外还有单细胞分泌蛋白质组及多重细胞因子蛋白质组芯片，3款芯片联用可以更全面地了解免疫细胞对不同治疗方案的功能性反应。

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